KTB4017-CN-亚硝酸还原酶（NiR）活性检测试剂盒（微量法）

亚硝酸还原酶（NiR）活性检测试剂盒（微量法）原理亚硝酸还原酶（NiR）是亚硝态氮还原过程中的关键酶，在自然界氮素循环过程中发挥着重要作用，其广泛存在于微生物及植物体内，能够催化亚硝酸盐还原，减少亚硝态氮在环境中的积累，降低其对生物体生长发育的毒害作用。CheKine™亚硝酸还原酶（NiR）活性检测试剂盒（微量法）能够检测植物组织、细菌、真菌样本中亚硝酸还原酶活性，其原理是亚硝酸还原酶可将NO2-还原为NO，使样本中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2-减少，即540nm处吸光值的变化可反映样本中NiR的活性。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TExtractionBuffer60mL120mL4℃ReagentⅠ2.8mL5.6mL4℃ReagentⅡPowder×1vialPowder×1vial4℃ReagentIII2.5mL5mL4℃ReagentIV5mL10mL4℃，避光保存ReagentV5mL10mL4℃，避光保存Standard1mL1mL4℃注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测540nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、制冰机、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentII：临用前配制；48T加入2.5mL去离子水，96T加入5mL去离子水，充分溶解待用。4℃可保存2周。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）。4℃保存。ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室温（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）。4℃避光保存。ReagentV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：ReagentI有毒，ReagentIV和ReagentV有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。WorkingReagent：临用前根据用量将ReagentIV和ReagentV以1：1的比例混合，现用现配。Standard：10µmol/mL亚硝酸钠标准溶液。4℃保存。标准品制备：10µmol/mL亚硝酸钠标准溶液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：序号Standard体积去离子水体积（µL）浓度（µmol/mL）Std.120µL10µmol/mLStandard9800.2Std.2500µLofStd.1(0.2µmol/mL)5000.1Std.3500µLofStd.2(0.1µmol/mL)5000.05Std.4500µLofStd.3(0.05µmol/mL)5000.025Std.5500µLofStd.4(0.025µmol/mL)5000.0125Std.6500µLofStd.5(0.0125µmol/mL)5000.00625Std.7500µLofStd.6(0.00625µmol/mL)5000.003125Std.805000（空白管）注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。组织：称取约0.1g的新鲜组织，加入1mLExtractionBuffer捣碎，冰浴超声波提取（300W，超声5s，间隔8s，总时间5min），10,000g，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测。细菌或真菌细胞：收集500万细菌或真菌细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或真菌细胞，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎细菌或真菌细胞3min（功率300W，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后10,000g，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤酶标仪或可见分光光度计预热30min，调节波长到540nm。可见分光光度计用去离子水调零。操作表（下述操作在1.5mLEP管中进行）：试剂基质管（μL）对照管（μL）测定管（μL）标准管（μL）样本020200去离子水204000ReagentⅠ400400ReagentⅡ4040400混匀后，25℃孵育1hReagentIII4040400充分震荡30s，常温静置5min，取上清至微量玻璃比色皿或96孔板中上清液7070700Standard00070WorkingReagent140140140140充分混匀，常温静置5min，测定540nm各管吸光值，分别记为A基质、A对照、A测定、A标准和A空白，计算ΔA测定=A基质-(A测定-A对照)，ΔA标准=A标准-A空白。注意：标准曲线、空白管和基质管只需测1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.7，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x(μmol/mL)。2.NIR活性的计算：按样本蛋白浓度计算：单位定义：每mg组织蛋白每小时还原1μmolNO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR(U/mgprot)=x×V反总÷V样×V样总÷(Cpr×V样总)÷T=x×7÷Cpr按样本鲜重计算：单位定义：每g组织每小时还原1μmolNO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR(U/g质量)=x×V反总÷V样×V样总÷W÷T=x×7÷W按细菌或真菌细胞数量计算：单位定义：每104个细菌或真菌细胞每小时还原1μmolNO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR(U/104)=x×V反总÷V样×V样总÷N÷T=x×7÷NV反总：取上清液前的反应体系体积，0.14mL；V样：加入的样本体积，0.02mL；V样总：加入的ExtractionBuffer体积，1.0mL；T：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或真菌细胞数量，104。结果展示Figure1.本试剂盒测定拟南芥和平菇中NiR的活性Figure2.StandardCurveofNi