KTB3120-CN-蔗糖磷酸化酶（SP）活性检测试剂盒（微量法）

蔗糖磷酸化酶（SP）活性检测试剂盒（微量法）原理蔗糖磷酸化酶（SucrosePhosphorylase，SP，EC）主要存在于微生物和植物中，属于糖基水解酶13家族，是一种催化转移葡萄糖苷键的酶，能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成1-磷酸-葡萄糖。该酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖为供体，多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体，催化合成各种糖苷。CheKine™蔗糖磷酸化酶（SP）活性检测试剂盒（微量法）可检测植物组织、真菌样本。在该试剂盒中，SP能够催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。通过340nm吸光度的增加速率来反映SP活性。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃AssayBuffer5mL10mL4℃ReagentⅠPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentII0.25mL0.5mL4℃，避光保存ReagentIII0.25mL0.5mL4℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·酶标仪或紫外光分光光度计（能测340nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentI：临用前配制；48T加入3.5mL去离子水，96T加入7mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂4℃避光保存2周。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。ReagentIV：临用前配制；48T加入0.7mL去离子水，96T加入1.4mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentV：临用前配制；48T加入0.7mL去离子水，96T加入1.4mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentVI：临用前配制；48T加入1.4mL去离子水，96T加入2.8mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。ReagentVII：临用前配制；48T加入1.4mL去离子水，96T加入2.8mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。植物组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。真菌：收集500万真菌到离心管内，用冷PBS清洗真菌，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎真菌30次（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），然后10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤酶标仪或紫外光分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：试剂测定孔（μL）对照孔（μL）AssayBuffer6585ReagentⅠ5050ReagentII33ReagentIII22ReagentIV1010ReagentV1010ReagentVI2020ReagentVII2020混匀，37℃保温5min样本200充分混匀，记录340nm处10s时吸光值A1，37℃反应10min记录130s时的吸光值A2。测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA=(A2测定-A1测定)-(A2对照-A1对照)。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.05可适当加大样本量。如果A大于1或ΔA大于0.6，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含SP或已降解。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。SP活性的计算使用96孔UV板测定的计算公式如下按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：37℃，pH6.8时，每毫克蛋白每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。SP(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1,608×ΔA÷Cpr按样本鲜重计算：酶活单位定义：37℃，pH6.8时，每克样本每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。SP(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=1,608×ΔA÷W按真菌数量计算酶活单位定义：37℃，pH6.8时，每104真菌每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。SP(U/104)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(n×V样÷V样总)÷T=1,608×ΔA÷nV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：真菌数量，以万计。使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d：0.5cm调整为d：1cm进行计算即可。结果展示以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。Figure1.本试剂盒测定玉米种子和芒果果实中SP的活性。相关产品CatalogNo.ProductNameKTB3110CheKi