微生物基本特点与鉴别科技为本创造健康生活讲解

制剂一厂QC闫占宽微生物基本特点与鉴别科技为本·创造健康生活微生物特点、影响生长繁殖因素产品召回中的微生物分析微生物鉴别策略与技术科技为本·创造健康生活微生物特性、影响生长繁殖因素种类多、分布广个体小，胃口大繁殖快、转化快适应强、易变异古菌：通常生活在地球上极端的环境或者生命出现初期的自然环境中，如超高温、高酸碱度、高盐及无氧环境，大多数营自养和异样生活。代表着生命的极限，确定了生物圈的范围。马迪根.微生物生物学[M].北京:科学出版社,2001MDD的困扰科技为本·创造健康生活一根头发的微生物培养结果手掌的微生物培养结果：手掌的微生物培养结果洗手后消毒后更衣顺序人体微生物分布种类科技为本·创造健康生活1014活的微生物，是人的一部分。其中皮肤有1012,口腔有1010,肠道1014.皮肤：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、科室葡萄球菌、棒状杆菌属、丙

酸杆菌、痤疮杆菌、微球菌属。口腔：唾液链球菌，血液链球菌。毛发：毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属。肠道：肠杆菌包括肠杆菌属,埃希菌菌属，乳酸杆菌，双歧杆菌，粪杆菌

属，梭菌人体微生物分布种类表皮葡萄球菌头状葡萄球菌科氏葡萄球菌棒状杆菌属丙酸杆菌痤疮杆菌微球菌属唾液链球菌血液链球菌毛癣菌属表皮癣菌属小孢子菌属肠杆菌属埃希菌菌属乳酸杆菌双歧杆菌粪杆菌属梭菌口腔皮肤毛发肠道科技为本·创造健康生活微生物在空气中的分布空气本身缺乏微生物生活所必需的营养物，日光对微生物也具有很强的杀菌作用，空气一般是干燥的，因此空气不是微生物生活的良好环境。（芽孢）空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的灰尘，这类微生物大人和动物，通过呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，悬浮在大气中。空气中存在较多的、存活时间较长的是各种真菌、放线菌的孢子及细菌芽胞。如果洁净区环境空气中检测出来的绝大部分是G+球菌，和普通空气中的分布是不同的，显然是人员散发出来的。科技为本·创造健康生活微生物特性、影响生长繁殖因素种类多、分布广个体小，胃口大繁殖快、转化快适应强、易变异影响微生物生长繁殖的因素固体粉末的水分活度一般0.5左右科技为本·创造健康生活1、原辅料检测时间长，导致的采购、生产压力；2、成品延长放行周期，增加了库存成本和市场销售压力。3、许多非无菌药品的微生物污染可能性很低，因此测试的价值不大。为什么想要减少微生物限度测试?需氧菌3~5天，霉菌酵母菌培养5~7天药品GMP指南：质量控制实验室与物料管理；Ch.p20159202非无菌产品微生物限度检査指导原则科技为本·创造健康生活固体原辅料水分活度:水分活度是对游离水的测定，不包括对结合水。同其他产品特性一样，如低或高pH、无营养物质、含表面活性剂、抗菌剂，能防止微生物生长耐受性较强的微生物，如能形成芽孢的梭菌、杆菌、沙门氏菌及丝状真菌，虽然它们并不在低水分活度的产品中增殖，但会存活在产品中降低水分活度对微生物生长的作用：

较长的停滞期、较慢的生长速度、较少的稳定期的微生物数量，减少微生物毒素的产生在某个微生物专有的水分活度以下，该微生物不会生长

水分活度下降后，微生物的耐热性会提高什么是水分活度？USP38<1112>科技为本·创造健康生活USP<1112>细菌水分活度(Aw)霉菌酵母菌水分活度(Aw)铜绿假单胞菌0.97黑根霉0.93蜡状芽孢杆菌0.95毛霉菌属0.92肉毒杆菌A0.95胶红酵母0.92大肠杆菌 0.95酿酒酵母菌0.90产气荚膜杆菌0.95拟青霉0.84绿色乳杆菌0.95产黄青霉0.83沙门菌0.95烟曲霉菌0.82产气肠杆菌0.94青霉菌属 0.81枯草芽孢杆菌0.90黄曲霉菌0.78微球菌属0.93黑曲霉菌（嗜高温）0.77金黄色葡萄球菌0.86嗜渗酵母0.62嗜盐杆菌0.75嗜干酵母0.61固体原辅料科技为本·创造健康生活产品水分活度最可能的污 建议的测试鼻腔吸入剂0.99革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞洗发香波0.99革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌抗酸剂0.99革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，大肠埃希菌，沙门氏菌 局部乳剂0.97革兰氏阴性菌TAMC，TCYMC，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌口服液0.90革兰氏阳性菌及真菌TAMC，TCYMC口服混悬剂0.87真菌TAMC，TCYMC局部膏剂0.55无减少测试唇用软膏0.36无减少测试阴道/直肠栓剂0.30无减少测试片剂0.36无减少测试充液胶囊0.30无减少测试USP<1112>科技为本·创造健康生活温度

在医学微生物研究方面，主要研究接近人体温度范围的微生物，因为只有这一温度下能够生长的微生物才最可能感染人体。所以培养温度一般在20~37℃的范围内。（这样的温度能培养出环境中的所有微生物？）

嗜寒性的G-细菌（可以生长在10℃的水中）存在于水中，并且是内毒素的来源，所以也是研究对象。影响微生物生长繁殖的因素人体环境EM

培养策略Cited：OliverGordon.ComparisonofDifferentIncubationConditionsforMicrobiologicalEnvironmentalMonitoring科技为本·创造健康生活什么是一个CFU在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量链球菌酵母医药方面相关微生物1、可多可少2、102科技为本·创造健康生活随着微生物增加，拥挤现象会降低估计值（争夺营养、空间）随着微生物减少，随机误差影响越来越大，导致不准确的估计平皿计数上限平皿计数下限（无法计数）科技为本·创造健康生活细菌结构（染色）G+细菌

细胞壁厚，主要成分是肽聚糖，占细胞干重的50%~80%.革兰氏染色呈紫色G-细菌

细胞壁薄，主要成分是LPS，有致热作用，是细菌内毒素有效成分。

革兰氏染色呈红色天然内毒素vsLPS科技为本·创造健康生活细菌生长周期无菌检查14天，痤疮杆菌生物指示剂培养时间Cited：HELENBATHGATE.TheIncubationPeriodinSterilityTestingPDAJPharmSciandTech1993,47254-257科技为本·创造健康生活典型的酵母是椭圆形，细胞壁主要是结构性多糖，葡聚糖占细胞壁干重50%~60%，甘露糖占15%~23%。葡聚糖主要以β-1,6-葡聚糖、β-1,3-葡聚糖（内毒素检验假阳性）、β-1,3-β-1,6-葡聚糖和壳多糖的混合物。（葡聚糖反应激活步骤少，延滞期短，速率低）菌落形态：大，疏松，绒毛状，絮状，蜘蛛网状，初期无色，后期产生孢子有颜色霉菌菌落什么会向洁净区引入霉菌

EM结果没有霉菌，并不代表环境中真的没有。可能是由于EM程序中缺少真菌特异性的监测。对真菌的警戒限缺乏真正的了解，最终导致污染。

1、丝状真菌更容易漂浮在空气中而不是附着在表面上，这是它们主要的传播途径。2、室内或厂房设备里面被丝状真菌污染，通常认为是曲霉属。洁净区，高枝孢菌和青霉菌常见，曲霉菌较少。3、回收种类方面、回收数量方面，SDA最好。实际环境监测，某些霉菌不能在SDA上生长，并不是说SDA不支持他们生长，可能是在洁净区处于亚致死状态，实验室复增后，就能够生长。一些在医药方面有价值的微生物微生物名称特征药用价值放线菌G+，丝状杆菌抗生素生产嗜热脂肪芽孢杆菌G+,杆菌、需氧，产芽孢湿热灭菌验证枯草芽孢杆菌G+，杆菌，需氧，产芽孢湿热灭菌验证、环氧乙烷灭菌验证短小芽孢杆菌G+，杆菌，需氧，产芽孢射线灭菌验证缺陷短波单胞菌G-，微需氧、杆菌0.22um滤芯截留实验生孢梭菌G+，杆菌，厌氧，产芽孢确认厌氧的生长条件大肠杆菌G-，肠杆菌，兼性厌氧生产内毒素标准品，防腐效力极限测试Cited：JulieSchwedock，BrevundimonasdiminutaisnotalwayssodiminutiveGrowthconditionsaffectsize.（PMF）/PDATR12007USP<1231>0.1umFBIO>12Cited：LUISJIMENEZ：MicrobialDiversityinPharmaceuticalProductRecallsandEnvironmentsPDA20071998~2006FDA产品召回情况产品召回1998~2006非无菌产品（134批）G-细菌

60%G+细菌

4%霉菌酵母菌

23%无菌产品(193批)缺乏无菌保障

78%霉菌酵母菌

7%G-细菌

6%G+细菌

1%洋葱伯克霍尔德菌（FDA建议），假单胞菌属、皮氏罗尔斯顿氏菌占48%科技为本·创造健康生活R2A培养基比营养琼脂检出多（菌落特点，小、透明、反光）有很多菌，在R2A也不能形成肉眼可见的菌落，荧光方法可以。还有很多菌，荧光法也不可以，但16sDNA可以（VBNC微生物）Milliflex®Quantum–DetectionofMicrobialContaminantsinWaterSamplesR2A培养基平皿计数如何操作？科技为本·创造健康生活

无菌产品78%缺乏保证，6%G-细菌，1%G+细菌。洋葱伯克霍尔德菌占比2.2%。霉菌酵母菌占比7%，主要是青霉菌属和曲霉菌属。主要是人员操作，环境缺乏控制，或者设计缺陷有关。环境结果很少出现霉菌，霉菌召回比却很高从1998到2006没有因为单独的G+细菌（人员皮肤如葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌）污染造成的召回。只有1%召回是含有G+菌。无菌制剂科技为本·创造健康生活鉴别神器存在吗？鉴别不出来怎么办？科技为本·创造健康生活USP38<1113>Ch.p9204微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种/属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的中，只需要做菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革兰氏染色或其它染色法、某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)，即可满足需要；非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平；

无菌试验结果阳性和培养基灌装失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平。科技为本·创造健康生活GMP实施指南-无菌药品环境监测14.6：对关键区、周围洁净区以及人员的监控，应包括将微生物鉴定到属（或必要时鉴定到种）的常规试验无菌检查15.3：如果将微生物鉴别结果作为判定无菌检查试验无效的惟一依据，则必须使用比微生物学/生物化学方法更为灵敏的技术，如确定RNA/DNA同源性的分子分型方法。科技为本·创造健康生活FDA：无菌生产工艺指南2004IX无菌保障9、培养基模拟灌装结果解释Anycontaminatedunitshouldbeconsideredobjectionableandinvestigated.ThemicroorganismsshouldbeidentifiedtospecieslevelX实验室控制关键洁净区及人员中的微生物鉴别到种/属Monitoringcriticalandimmediatelysurroundingcleanareasaswellaspersonnelshouldincluderoutineidentificationofmicroorganismstothespecies(or,whereappropriate,genus)level.科技为本·创造健康生活现行的是：《伯杰氏系统细菌学手册》第二版，共五卷第一卷、古生菌、蓝细菌、光合细菌和最早分支的属古生菌2001年出版第二卷、变形杆菌第三卷、低G+C含量的革兰氏阳性细菌2009年出版第四卷、高G+C含量的革兰氏阳性细菌2010年出版第五卷、放线菌2012.05出版，中国放线菌学家在这方面做出杰出贡献参考：李文均，职晓阳，

唐蜀昆：我国放线菌系统学研究历史、现状及未来发展趋势科技为本·创造健康生活本版本与之前版本的重要区别是，其内容是依据16SRNA

的核苷酸序列分析，按照系统发育为框架编写的，而不是按照表型结构编写的。系统发育树或树状图显示了微生物之间的遗传关系。这项技术的应用导致了一些已知微生物的分类和命名修改。例如，ATCC16404即真菌黑曲霉被重名为巴西曲霉（CMCC98003未改）。一般而言，微生物亲缘关系小于或等于97%被认定为不同的属，那些亲缘关系小于或等于99%被认定为不同的种。基因和表型的差异性相对比较少见。具有相同或非常相似基因的微生物具有不同的表型、具有相似表型的却具有不同的基因，不能被归为同种或同属。当微生物特征、试验历史记录和分离来源被考虑进来时，可以避免单独使用基因数据做出毫无意义的结论。资源是有限的科技为本·创造健康生活在我的日常监控中，什么时候需要鉴别到种属？发生了微生物偏差

培养基模拟灌装（分装）试验出现的阳性样品中的微生物；

无菌检查中，检品或者阴性对照呈阳性的微生物；无菌生产工艺中，过滤前药液微生物污染水平检查出现的微生物（出现就鉴别，可以更佳的评估风险）；（100ml检验量依据）

最终灭菌工艺中，灭菌前药液微生物污染水平检查超标或耐热性检查呈阳性的微生物；（F0>8和F0>12检验项目区别）

微生物限度检查中，结果超标时的微生物；控制菌检查中，当出现疑似菌落，不能确定是否为所检控制菌的时候（标准102）

环境监测数据超过标准、水监测超过标准、原辅料监测超过标准Cited：HARRYYANG.ARisk-basedApproachtoSettingSterileFiltrationBioburdenLimits科技为本·创造健康生活在我的日常监控中，什么时候需要鉴别到种属？需要了解微生物种类分布的情况

无菌灌装工艺中，A级区和B级区日常环境监测发现的微生物；

与关键区相邻的C\D级别选择鉴别，用于研究外部和关键区的微生物之间的关系

工艺用水系统中出现的微生物，主要包括：纯化水储罐和分配系统，注射用水制备系统、储罐和分配系统。（选择性鉴别）需要进行确认的情况

外购的标准菌株，为防止运输和其他原因造成的错误，传种的同时进行鉴别确认外购的生物指示剂，鉴别以确定种类没有误差

为什么不全部鉴别？致病菌策略是什么？（被提缺陷？）科技为本·创造健康生活试验结果革兰氏染色鉴别结果菌落描述：直径约3mm圆形，黄色，表面有光泽，不透明，质地均匀，隆起，边缘整齐。革兰氏染色G+球菌API鉴别选用APIstaph生化图谱620610鉴别结果：克氏库克菌克氏库克菌(MicrococcusKristinae)主要分布在自然环境及哺乳动物皮肤，是一种极罕见的机会致病菌。科技为本·创造健康生活科技为本·创造健康生活

待鉴定的微生物可以采用划线纯化，必要时可再次划线纯化，直至获得单菌落。同一培养皿上有两个或两个以上外观相同的菌落时，可仅纯化一个菌落进行鉴别。

在硫乙醇酸盐流体培养基中生长的微生物必须同时划线两块平板，一块用于厌氧培养（厌氧培养基），一块用于需氧培养。参考：李家琪，唐明清：清除硫乙醇酸盐培养基内絮状沉淀物方法的实验科技为本·创造健康生活微生物类别单细胞微生物菌丝状微生物细菌酵母菌放线菌霉菌主要特征细胞形态特征小而均匀、个别有芽孢大而分化细而均匀粗而分化相互关系单个分散或按一定方式排列单个分散或假丝状丝状交织丝状交织菌落含水情况很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥外观特征小而突起或大而平坦大而突起小而紧密大而疏松或大而致密参考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落与培养基结合度不结合不结合牢固结合较牢固结合菌落的颜色多样单调十分多样十分多样菌落正反面颜色差别相同相同一般不同一般不同细胞生长速度一般很快较快慢一般较快气味一般有臭味多带酒香常有泥腥味霉味用语标准化科技为本·创造健康生活涂片：在洁净载玻片上滴加纯化水1-2滴，将分离所得菌用接种环挑取1环均匀涂在纯化水中。

干燥固定：酒精灯高处微微加热。

染色：在整个涂面上滴加结晶紫染色液（或其它染色液），染色１分钟

水洗：倾去染液，用纯化水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止干燥：空气中自然干燥。镜检：观察结果。简单染色科技为本·创造健康生活革兰氏染色

选用培养18~24小时的微生物进行革兰氏染色；涂片：在洁净载玻片上滴加纯化水1-2滴，将分离所得菌用接种环挑取1环均匀涂在纯化水中。干燥固定：酒精灯高处微微加热。（死亡）初染：在做好的涂面上滴加结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。媒染：先用路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗复染：滴加沙黄染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。

镜检：观察染色结果。呈紫色者为革兰氏阳性菌，红色者为阴性菌。

科技为本·创造健康生活生化筛选1、氧化酶试验，区分革兰氏阴性菌，非发酵的棒状细菌(氧化酶阳性)和肠道菌(氧化酶阴性);2、过氧化氢酶试验，区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性)和链球菌(过氧化氢酶阴性);3、凝固酶试验，区分凝固酶阴性葡萄球菌(可推测为非致病性)和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性)4、3%氢氧化钾实验，区分革兰阴性细菌和易脱色的革兰阳性细菌。

由于革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖层数少，在稀碱溶液内易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使KOH菌悬液呈现粘性，搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌在稀碱溶液中仍保持不变。科技为本·创造健康生活表型微生物鉴定表型鉴定依据基因物质的表达来区分不同微生物间的差异，通常需要大量相关的纯化细胞、单