医学资料 DNA基因测序

毛细管凝胶电泳与DNA基因测序

赵志峰DNA是主要的遗传物质资料1：20世纪30年代，科学家认识到：组成DNA分子的基本单位是

。脱氧核苷酸1分子磷酸1分子脱氧核糖1分子含氮碱基高中知识回顾1分子脱氧核苷酸=

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.【模型建构1】:脱氧核苷酸碱基AGCT磷酸脱氧核糖ACT腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸G脱氧核苷酸的种类1、DNA分子结构主要特点DNA分子是有

条链组成，

盘旋成

结构。

交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在内侧。碱基通过

连接成碱基对，并遵循

原则。反向平行双螺旋脱氧核糖和磷酸碱基对氢键碱基互补配对2AP脱氧核糖GP脱氧核糖CP脱氧核糖TP脱氧核糖脱氧核糖APGPCPTP脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖DNA分子的复制1.条件：

(1)模板：解旋的DNA两条单链

(2)原料：脱氧核苷酸

(3)能量：ATP

(4)酶：解旋酶、DNA聚合酶2.特点:

(1)边解旋边复制

(2)半保留复制3.“准确”复制的原理：

（1）DNA分子独特的双螺旋结构，为复制提供了精确的模板；

（2）碱基互补配对原则，保证了复制能够准确地进行。

元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础元素周期表“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！

“基因组”----生命科学的“元素周期表”人体解剖图奠定了现代医学发展的基础生命的奥秘蕴藏于“四字天书”之中…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…DNA测序的基本原理一、脱氧链终止法测序

基本原理：

利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。用于终止反应的双脱氧核苷酸：将2’，3’–双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’–羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。O碱基CPOH12345O碱基CPHH12345H2O脱氧核苷酸的连接O碱基CPHH12345O碱基CPOHH12345OHX双脱氧核苷酸…?

在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。电泳电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳正极负极带负电粒子带正电粒子凝胶电泳定义：凝胶电泳利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离：相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，小分子溶质泳动速度较快。经过一段时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。毛细管凝胶电泳将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。毛细管

1装置

毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液高压电源

（可高至30KV）

（二）新生链的荧光标记原理多色荧光标记法--荧光标记终止底物法定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息

（二）新生链的荧光标记原理荧光标记引物法荧光标记引物法原理（二）新生链的荧光标记原理模板：TCCATGAT产物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACTAGCTGGTTAAC

染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用激光扫描镜头实时扫描不同大小的DNA片段在相应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将不同大小DNA片段发射的荧光实时地传递给计算机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶图文件及原始数据信号。当电泳完毕后，DNA序列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，得到最终的测序结果。仪器的组成--PE310基因分析仪PE310基因分析仪的结构凝胶块区

自动进样器区

检测区

仪器的组成--PE310基因分析仪PE310基因分析仪的主机分区热板毛细管雷射检测器注射器驱动杆毛细管和电极注射器正极缓冲液泵块自动进样器负极缓冲液PE310基因分析仪的基本结构DNA的检测原理测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段

DNA的检测原理DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理整个电泳过程结束时在检测区