谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒实验解决方案

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒实验解决方案原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与活性氧（ROS）反应，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-Px的必需部分，测定GSH-Px的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。CheKine™谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动物组织、细胞、细菌样本中GSH-Px的活性。GSH-Px催化H2O2氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）·恒温箱·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·低温离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。WorkingSubstrate：临用前配制，Substrate加入20mLAssayBuffer，充分溶解；未用完的试剂分装避光于-20℃保存1个月。GR：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。WorkingH2O2：临用前配制，吸取21.5μLH2O2加入5mL去离子水，充分混匀，配制好的试剂当天使用；4℃避光保存。WorkingReagent：临用前配制，根据样本数量，按照2mLWorkingSubstrate加入1μLGR的比例配制，再加6mL的AssayBuffer混匀（当天用完）；WorkingRegent在25℃（其他物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min以上。样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。1.组织样本：用冷的PBS清洗组织，尽可能去除血液。吸干组织上的水分，称重。称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的AssayBuffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。2.血清（浆）：直接测定（如需要可用生理盐水稀释不同倍数）。3.细胞、细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的AssayBuffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。注意：样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；细胞中GSH-Px活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GSH-Px的提取时可加AssayBuffer后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计用去离子水调零。2.WorkingRegent于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）孵育30min。3.在96孔UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加样：试剂空白孔（μL）测定孔（μL）去离子水200Sample020WorkingReagent160160WorkingH2O220204.充分混匀，空白孔在340nm处第10s和第10min10s的吸光值，分别记为A1，A2，测定孔在340nm处第10s和第10min10s的吸光值，分别记为A3，A4，计算ΔA空=A1-A2，ΔA测=A3-A4。注意：空白孔只需做1-2个即可。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用AssayBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。使用96孔UV板测定的计算公式如下：1.按蛋白浓度计算GSH-Px活力单位定义：在25℃或37℃温度下，每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/mgprot)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)÷Cpr2.按样本鲜重计算GSH-Px活力单位定义：在25℃或37℃温度下，每克样品每分钟催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/g鲜重)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)÷W3.按细胞或细菌数量计算GSH-Px活力单位定义：在25℃或37℃温度下，每104个细胞或细菌每分钟催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/104)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)÷5004.按液体体积计算活性单位定义：在25℃或37℃温度下，每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/mL)=[(ΔA测-ΔA空)÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=321.6×(ΔA测-ΔA空)ΔA空=A1-A2，ΔA测=A3-A4；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W：样品质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=2×10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；500：细胞或细菌数量，500万。使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。相关产品CatalogNo.ProductNameKTB1600Che