液相色谱法(共34张课件)

液相色谱法第1页，共34页。1月6日(星期日)补1月3日（星期四）的课程第2页，共34页。第十章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC一、HPLC概述二、高效液相色谱仪三、高效液相色谱法的类型第3页，共34页。一、高效液相色谱法概述气相色谱：流动相为气体液相色谱：流动相为液体，70年代以后，在高压下输送流动相，称之为高效液相色谱（高压液相色谱），简称为HPLC。HPLC与GC主要差别：分析对象差别

GC（20％）：能气化、热稳定性好且沸点较低的样品，

HPLC（80％）：溶解后能制成溶液的样品，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测流动相差别GC：流动相为惰性气体；组分与流动相无作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体（种类多，另可选用不同比例的多种液体作为流动相）；流动相与组分间有亲合作用力，柱选择性好、分离效果佳操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压第4页，共34页。二、高效液相色谱仪高效液相色谱仪简单流程图第5页，共34页。2.1高压输液系统贮液器：贮存流动相，由玻璃、不锈钢或氟塑料作成（0.5~2L）高压泵：作用：将贮液器中的流动相以高压（150～350×105Pa）形式连续不断地送入柱系统性能：高压、恒流、压力变化小、流量范围可调、耐腐蚀、密封性好主要类型：往复式柱塞泵（恒流）当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。第6页，共34页。（内梯度）（外梯度）梯度洗脱置（程序升温装置）：概念：在分离过程中使用两种或两种以上的不同极性的溶液为流动相，通过不断改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH或离子强度相应的改变，从而使各组分以它们的最佳k’值通过色谱柱，达到高的分离效果。分类：内梯度和外梯度第7页，共34页。LC梯度洗脱与GC程序升温的比较a、弱溶剂时，k’大的组分未流出；b、强溶剂时，k’小的组分分不开；c、中等强度溶剂时，k’小的组分1，2分不开；d、梯度洗脱，各组分得到良好的分离第8页，共34页。2.2进样系统作用：把分析试样有效地送入色谱柱进样方式：微量注射器；进样阀（耐高压的六通阀：自动化进样、重现性好）第9页，共34页。2.3分离系统（色谱柱）作用：实现组分的分离性能：直形（由不锈钢制成）；内径：2~6mm；长度：10~50cm2.3检测系统作用：检测并收集各组分类型：溶质型检测器和总体检测器两种溶质型检测器：对被分离组分的物理或物理化学性质有响应，例：紫外、DAD、荧光、电化学检测器等总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，例：示差折光、介电常数检测器等第10页，共34页。紫外检测器：应用最广，可用于梯度洗脱，对大部分有机化合物有响应光源：低压汞灯，254或280nm（固定波长）；氢灯、氘灯，200-400nm（可调波长）检测池：很小，（1mm×10mm，容积小于10μL）；接收元件：光电倍增管二极管阵列检测器（DAD)：可得到所有波长上的色谱信号第11页，共34页。

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第12页，共34页。脲的取代物与氨基甲酸酯的高速分离降低背景电导(淋洗液)：减少噪音化学键合相色谱（CBPC)化学键合相色谱（CBPC)聚乙二醇、氨基与腈基键合相C18（简称ODS）、C8粘度小，以此提高柱效硝基苯胺异构体在10m氧化铝上的LSC分离淋洗液：9mmol/LNa2CO3

流速：1mL/min

进样量：25µLHPLC与GC主要差别：HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC电导检测器：检测具有电导性化合物的通用型检测器，最常用。主要测定高氯物质中的NO2-，NO3-等离子惠普公司—1100型液相色谱仪第13页，共34页。三、HPLC的主要类型及分离原理流动相要求：流动相纯度高不使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂能溶解样品，但不与样品发生反应粘度小，以此提高柱效与所选用的检测器匹配固定相分类：承受压力：刚性固体（可承受高压，以二氧化硅为基质，表面键合各种官能团，成化学键合固定相）；硬胶（承受压力低，由聚苯乙烯和二乙基苯交连而成）孔隙深度：表面多孔型和全多孔型第14页，共34页。液固色谱（LSC,liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；

第15页，共34页。应用：用于分离相对分子量中等的油溶性物质，另用于分离不同官能团的化合物和异构体。缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象（2）应用和缺点脲的取代物与氨基甲酸酯的高速分离第16页，共34页。硝基苯胺异构体在10

m氧化铝上的LSC分离第17页，共34页。液液分配色谱（LLPC)固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。第18页，共34页。固定相：将固定液化学键合于载体（硅胶）表面形成固定相固定相类型：极性固定相：正相色谱以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的非极性固定相：反相色谱反相色谱法最常用的固定相是C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）和苯基键合相的填料。化学键合相色谱（CBPC)固定相使用条件：为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18使用的pH值通常为2.5~7.5。太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。第19页，共34页。正相色谱法反相色谱法1.极性固定相聚乙二醇、氨基与腈基键合相2.相对非极性流动相正已烷、环已烷3.极性调节剂

乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷4.分离中等极性和极性较强化合物.

酚类、胺类、羰基类及氨基酸类5.组分流出顺序极性小先洗出1.非极性固定相C18（简称ODS）、C82.极性流动相水或缓冲液3.极性调节剂

甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物占整个HPLC应用的80%左右5.组分流出顺序极性大先洗出第20页，共34页。IC是HPLC的一种，是分析水溶液中阴离子的最佳方法。固定相是离子交换树脂，流动相是淋洗液(强电解质)；电导检测器。常用的淋洗剂是Na2CO3-NaHCO3混合液。只要改变两种物质的浓度比，就可以得到不同淋洗能力和pH值的流动相。为消除淋洗液中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱或抑制器。离子色谱法（IC）第21页，共34页。ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－临时过程ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（1）原理：离子交换（离子价态和离子半径）第22页，共34页。淋洗液瓶Pump保护柱分析柱抑制器装置电导池色谱工作站淋洗液输送离子交换分离抑制电导检测数据采集和仪器控制样品注射（2）离子色谱结构第23页，共34页。电导检测器：检测具有电导性化合物的通用型检测器，最常用。溶液至检测池电极检测池抑制器：安装在电导池之前提高待测离子的电导率：提高灵敏度Na+,Cl-H+,Cl-

降低背景电导(淋洗液)：减少噪音Na+,HCO3-H2CO3Na+,OH-H2O第24页，共34页。极限摩尔电导值

阳离子

＋－阴离子

Ｈ＋Ｌｉ＋Ｎａ＋Ｋ＋ＮＨ４＋Ｍｇ２＋Ｃａ２＋ＯＨ－Ｆ－Ｃｌ－Ｂｒ－ＮＯ３－ＰＯ４３－ＳＯ４２－198554678718080（单位：μS/m当量）350395074735360第25页，共34页。抑制器的作用背景：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～保留时间电导NaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4背景：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～保留时间电导HFHClHNO3H3PO4H2SO4保留时间背景：H2CO3(15μS)电导第26页，共34页。免试剂离子色谱（Reagent-Free™）：传统离子色谱的问题——手工配制淋洗液和再生液（3）离子色谱的最新发展离子色谱样品前处理常规样品离子分析痕量离子分析大体积进样在线浓缩复杂基体中离子的处理预处理小柱第27页，共34页。分离原理：基于分子尺寸的大小进行分离，样品组分与固定液间不存在相互作用现象溴离子 25

7.分离非极性和极性较弱化合物固定相的排阻极限：因分子量过大而不能部分地进入某一给定固定相孔内的最小的样品粒子的分子量脲的取代物与氨基甲酸酯的高速分离C18预处理小柱、On-GuardRP\P柱——去除有机分子贮液器：贮存流动相，由玻璃、不锈钢或氟塑料作成（0.应用：用于分离相对分子量中等的油溶性物质，另用于分离不同官能团的化合物和异构体。电导检测器：检测具有电导性化合物的通用型检测器，最常用。4.降低背景电导(淋洗液)：减少噪音电导检测器：检测具有电导性化合物的通用型检测器，最常用。二极管阵列检测器（DAD)：可得到所有波长上的色谱信号Na2HPO4,Na2SO4Na2HPO4,Na2SO4液液分配色谱（LLPC)SPE小柱过滤：样品中有颗粒状物质基体消除：*去除样品中所包含的，有可能损坏仪器或者影响色谱柱/抑制器性能的成分——重金属离子、有机大分子*去除样品中所包含的，有可能干扰目标离子测定的成分——高离子强度基体0.22，0.45um滤膜——去除颗粒状杂质C18预处理小柱、On-GuardRP\P柱——去除有机分子On-GuardH柱——去除溶液中的金属离子On-GuardAg柱——去除溶液中的Cl-离子主要测定高氯物质中的NO2-，NO3-等离子On-GuardBa柱——去除溶液中的硫酸根第28页，共34页。水中阴阳离子测定的样品前处理第29页，共34页。（4）应用：在IonPacAS9-HC上分离消毒副产物色谱柱：IonPacAG9-HC,AS9-HC淋洗液：9mmol/LNa2CO3

流速：1mL/min

进样量：25µL色谱峰：1.氟离子3 mg/L2.亚氯酸根 103.溴酸