单源抗体制备与应用学习资料

單源抗體製備與應用李龍湖國立中興大學獸醫學系教授95年10月12日抗體（Antibody,Ab）抗原（Antigen,Ag）半抗原（Hapten）抗原決定位（Epitope）多價抗體（PolyclonalAb）抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子單源（株、價）抗體（MonoclonalAb）抗體溶液中僅含一種抗體分子抗原特異性抗體（monospecificAb）屬於多價抗體抗體共同確認特定抗原抗體特性比較特性單源抗體多價抗體抗原特異性抗體特異性高低高/低濃度高低低供應限制無有有MAb製備流程圖1.細胞融合（脾臟細胞＋骨髓瘤細胞）抗原BALB/C小白鼠PEG融合劑培養液（RPMI1640,DMEM）HAT試藥骨髓瘤細胞（NS1,SP2）2.陽性細胞株篩選與確認ELISAIFAWesternblot雙重確認3.細胞株化極限稀釋（Limiteddilution）餵飼細胞陽性細胞再確認4.單源抗體定性Isotype鑑定免疫沈澱（和抗原特異性結合）抗體濃度生物活性測定（如中和作用）和抗原決定位結合（線狀或構型抗原決定位）5.單源抗體生產與純化A細胞上清液收集及抗體純化抗體濃度低（小於1mg/ml）不含胎牛血清培養液BBALB/C小白鼠生產抗體Pristane處理，一週後注射融合瘤細胞採集腹水，純化抗體抗體濃度高（通常為數個mg/ml）6.細胞保存和解凍保存液含胎牛血清和抗凍劑10%DMSO連續降溫溫度越低，保存越久迅速解凍隔天觀察生長情形及換液7.細胞污染或生長不良處理黴漿菌污染抗生素，抗黴菌劑使用小鼠腹腔接種單源抗體應用研究治療：濃度高，動物使用多免疫藥理學，免疫基治療等檢驗試劑:病原食品藥（毒）物蛋白質等實例家禽Reovirus非結構蛋白σNS抗原決定位分析細菌表現蛋白σNS免疫細胞融合抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色細胞株化及確認抗體定性Table1.PropertiesofmonoclonalantibodiesdirectedagainstthenonstructuralproteinσNSofARV-S1133*ConcentrationofasciticimmunoglobulinprecipitatedwithammoniumsulfatewasdeterminedaccordingtoBio-RadStandardAssayProcedures.N:NativeσNSPC:PolyclonalantibodyD:DenatureσNSNC:NormalcontrolserumV:Virus-infectedcellextractsC:Mock-infectedcellextracts1to10:ImmunoprecipitateswithMAbs1:47C,2:4A21,3:4A125,4:4A23,5:1F9,6:4B9,7:Gall,8:4A123,9:5F9,10:H1E1Competition(%)=()100%A:ODwithoutacompetitingAbB:ODwithahomologousAbn:ODwithacompetitorA–nA–BTable2.ResultsofcompetitivebindingassaybetweenmonoclonalantibodiestoARV-S1133nonstructuralproteinσNSCompetitionmorethan60%,++;competitionbetween35%and60%,+;competitionlessthan35%,-.EpitoperecognizedbyMAbs5F9andGa11wasnotclassified(U).1.Poly(A)-sepharose+σNS2.σNS+MAbs(1:5)3.σNS+MAbs(1:500)4.σNS+MAbs(1:5000)5.Normalserum+σNS6.σNS+anti-σNSAb7.Sepharose+σNS8.Sepharose+σNS+MAb1F9MAbcaptureELISAfordetectingAbtoARVσNSMAb1E1Antigen1.ExpressedARVσNS(eσNS)

CoatingMAb+CrudeeσNSpreparationCoatingpurifiedeσNS

2.Virus-infectedCEFlysate

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