药品生物检定的基本概念和任务-生物检定用仪器分析技术

色谱分析技术

1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。什么是色谱法？

色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数等的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。

两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。吸附→解吸→再吸附→再解吸色谱过程对复杂混合物各组分进行定量和定性分析色谱法的特点1．分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。2．检测能力强：可以检测出10-11~10-15克级的痕量组分，能满足环境检测、农药残留等大量日常检测分析的需要。3．样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。4．适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之地。色谱分类流动相与固定相聚集态色谱分类根据固定相的形状：纸色谱、薄层色谱和柱色谱。根据分离操作方式：间歇色谱、连续色谱检测器色谱检测器是一个将组分浓度和量信息转化为电信号的传感器，信号的大小和组分的浓度或量成正比。现用的液相色谱的检测器分为两种：①普通检测器：它是测定流动相加人溶质后的某种物理性质的变化；②溶质性质或选择性检测器：它只对溶质的某些性质是灵敏的。液相色谱的主要检测器有紫外检测器、示差折光检测器和蒸发散射光检测器等。检测器检测下限/(g/ml)线性范围选择性梯度淋洗主要特点UV-Vis10-10103～104有可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光10-12～10-11103有可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响电化学10-10103有困难选择性高；易受流动相pH值和杂质的影响；稳定性较差。蒸发光散射10-9无可可检测所有物质。示差折光10-1104无不可可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感。质谱10-10无可主要用于定性和半定量。气相色谱气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异，以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合物的色谱方法。气相色谱法的特点优点：分离效率高、应用范围宽、分析速度快、样品用量少;

灵敏度高、分离和测定一次完成、自动化程度高.缺点：不适用于高沸点（>450℃）、有生物活性的物质的分离测定不适用于制备.待测样品在高温的气化室气化后在惰性气体的带动下进入色谱柱，色谱柱内含有液体或固体固定相每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立。由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附、解吸。结果是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出色谱柱，进入检测器。甲醇和乙醇混合样色谱图高效液相色谱高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。高效色谱仪首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。蔬菜、水果中农药残留的检测笨和丙酮混合样的色谱图液相色谱的主要特点是：分离效率高；选择性好，适用于多种多元组分复杂混合物的分离；应用范围广。从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。离子交换色谱法——

此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离。

例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。主要色谱方法凝胶渗透色谱亲和色谱分子印迹色谱技术色谱相关术语

试样经色谱柱获得分离，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变成电信号，由记录仪记录下信号—时间曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。色谱相关术语由色谱流出曲线可直接得到的相关术语：基线色谱峰色谱时间由色谱流出曲线可间接得到的相关术语：色谱体积相对保留值基线(Baseline)

在色谱操作条件下，仅有流动相通过检测器时，由记录仪得到的信号—时间曲线。基线漂移：基线随时间定向缓慢的变化。基线噪声：由于各种原因引起的基线波动。不论有无组分流出，其噪声均存在，它是一种背景信号。色谱峰(Chromatographicpeak)流动相带着组分通过检测器时，由记录仪得到的信号—时间曲线。峰底(Peakbase)：从峰的起点到峰的终点之间连线。峰高(Peakhight)：峰的顶点至峰底的垂直距离,通常用h表示。峰面积（Peakarea）：峰与峰底之间的面积，用A表示。色谱峰区域宽度(Peakwidth)

是色谱流出曲线的一个重要参数，它直接反映了分离条件的好坏。习惯上有下面三种表示方法：1）标准偏差：峰高0.607处色谱峰宽度的一半,用σ表示。2）峰宽或基线宽度：通过峰两侧的拐点作切线与峰底相交的宽度，用Y表示。与标准偏差的关系为：Y=4σ。3）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度,用Y1/2表示。与标准偏差的关系为：Y1/2=2σ(2ln2)1/2。色谱时间色谱时间主要有：死时间（Deadtime）：不被固定相吸附或溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。保留时间（Retentiontime）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。调整保留时间(AdjustedRetentionTime)：调整保留时间指组分的保留时间扣除死时间后的时间，用tR’表示。tR’=tR-tM相对保留值（RelativeRetentionValue）相对保留值指某组分i与基准组分s的调整保留值之比。通常用ris表示。制剂分析技术

提纲§1药物制剂分析特点

§2片剂分析√

§3注射剂分析√§4复方制剂分析

药物制剂性状分析特点药物制剂鉴别特点药物剂型检查特点杂质检查剂型检查及安全性检查药物制剂含量测定特点§1药物制剂分析特点药物制剂类型药物制剂原料药物或与适宜辅料制成的供临床使用的剂型;活性药物成分的临床使用形式。药物制剂类型片剂：口服普通片为主,还有含片、咀嚼片、分散片、泡腾片、缓释片、肠溶片等；注射剂注射液注射用无菌粉末注射用浓溶液

药物制剂分析特点

药物制剂分析比原料药物分析更困难

药物制剂组成复杂(含辅料),需样品预处理排除辅料对分析的干扰；药物制剂中活性药物成分含量低,需更灵敏的方法；药物制剂需剂型检查；剂型不同,质量控制项与质量指标及排除辅料干扰的方法也不同药物制剂分析与原料药分析对比（醋酸氢化可的松为例）药物制剂分析与原料药物分析相比性状:原料药:感观、溶解性及理化常数;药物制剂:感观;鉴别:原料药:方法较多;药物制剂:经样品预处理后选用部分原料药鉴别试验;检查:原料药:有关物质和干燥失重;药物制剂:剂型检查;含量测定:原料药:无样品处理；药物制剂:须样品预处理。不同制剂类型对比不同的药物制剂相比给药方式及给药部位不同,药物制剂的质量控制强度不同,口服片剂最弱,注射剂最强；剂型不同，药物制剂的剂型检查项目及样品预处理方法不同一.药物制剂性状分析特点药物制剂质量控制的组成部分；一定程度上综合表征药品质量。二.药物制剂鉴别特点

以原料药鉴别方法为基础采用原料药鉴别实验:辅料不干扰药物鉴别；样品预处理方法排除干扰;

取消该鉴别方法；

改用分离分析方法；辅料干扰药物鉴别二.药物制剂鉴别特点例阿司匹林及普通片的鉴别阿司匹林:+FeCl3→紫堇色①;IR③;+Na2CO3+H2SO4(过)→↓白+HAc臭气②阿司匹林片:+FeCl3→紫堇色;HPLC;片剂鉴别采用原料药鉴别试验①，取消鉴别试验②和③，增加HPLC三.药物剂型检查特点例

葡萄糖及其注射液的检查葡萄糖检查项：酸度、…、微生物限度；葡萄糖注射液：pH值、5-羟甲基糠醛、重金属、无菌、细菌内毒素、其他（注射剂项下规定）葡萄糖:杂质检查，安全性检查(微生物限度)葡萄糖注射液

杂质检查

剂型检查（其他）安全性检查（无菌、细菌内毒素）pH（更精确）5-羟甲基糠醛（生产中产生）重金属（生产中增加）药物制剂多与原料药的含量测定方法不同采用原料药含量测定方法:辅料不干扰药物含量测定；过滤、提取、分离法排除干扰再测定或选择性强法:辅料干扰药物含量测定浓缩法提高供试液浓度再测定或灵敏度高法:小剂量制剂；超声等法使药物完全释放再测定:缓、控释制剂；专属性强分离分析方法:复方制剂。四.药物制剂含量测定特点四.药物制剂含量测定特点例

硫酸沙丁胺醇及其制剂的含量测定硫酸沙丁胺醇:非水溶液滴定法；硫酸沙丁胺醇胶囊:HPLC法，内容物用流动相振摇使其溶解…硫酸沙丁胺醇缓释胶囊:HPLC法，内容物用0.1mol/L盐酸超声使其溶解…制剂与原料药含量测定方法不同:排除辅料干扰后，用灵敏度高、专属性强的HPLC;不同剂型含量测定方法相同，但样品预处理方法不同§2

片剂分析片剂（tablet）:原料药物或与适宜的辅料混匀压制而成的圆形或异形的片状固体制剂。口服普通片为主片剂分析性状分析鉴别试验剂型检查含量测定重量差异与含量均匀度崩解时限与溶出度糖类干扰及其排除硬脂酸镁干扰及其排除一.性状制剂通则”片剂下规定圆形或异形片状固体制剂外观完整光洁色泽均匀

符合正文各品种项下的性状描述二.鉴别试验过滤、离心、提取方法等排出辅料干扰；参考其原料药鉴别方法；一组鉴别试验:2～4种不同原理(化学、光谱、色谱和其他方法)。三.剂型检查ChP2015四部“制剂通则”片剂项下规定口服普通片剂型检查:重量差异和崩解时限;原料药与辅料难混匀:含量均匀度替代重量差异；片剂中活性药物成分难溶于水:溶出度替代崩解时限。药物片剂各片中活性药物成分的含量因制剂生产中的多种原因而产生差异；需要控制药物制剂的剂量单位均匀度；重量差异或含量均匀度表示1.【重量差异】(weightvariation)原料药与辅料混匀，用重量差异检查药物片剂的剂量单位均匀度；定义:片重与平均片重之差异平均片重重量差异限度<0.3g/片±7.5%≥0.3g/片±5%（1）规定糖衣片包衣前检查；薄膜衣片包衣后检查1.【重量差异】(weightvariation)（3）判断:超出限度片≤2片;超出限度1倍片≤1片。()平均片重(标示片重)素片片20每片重量与平均片重比较（2）方法总重PharmaceuticalAnalysis⑴定义:小剂量的制剂每片(个)含量符合标示量的程度2.【含量均匀度】(contentuniformity)

标示量≯25mg或≯25%应检查含量均匀度；检查此项的制剂不再检查重量差异。⑵方法取10片,测定每片以标示量为100的相对含量X。原料药与辅料难混匀，用含量均匀度代替重量差异PharmaceuticalAnalysis第十八章崩解仪3.【崩解时限】(disintegration)口服固体片剂在胃肠道中的崩解是药物溶解、被机体吸收及发挥药理作用的前提；崩解时限是口服药物片剂的常规剂型检查项；定义:口服固体制剂在规定条件下，全部崩解溶散或成碎粒所需时间限度。PharmaceuticalAnalysis第十八章对于难溶性药物的片剂，药物的溶出与其吸收及产生疗效具有更高的相关性；难溶性药物片剂的溶出度代替崩解时限。4.【溶出度】(dissolution)PharmaceuticalAnalysis第十八章

定义:规定条件下,活性药物成分从片剂等制剂中溶出的速度和程度。模拟口服固体制剂在胃肠道里的崩解和溶出情况的体外试验法；用于难以溶解药物及缓控释制剂(释放度)；检查该项的药物无需崩解时限检查。4.【溶出度】(dissolution)PharmaceuticalAnalysis第十八章方法

6片;500～1000mL溶剂;37±0.5℃;转速50～200r/min；

规定的方法,规定的时间点取样,0.8μm微孔滤膜过滤,

测定每片溶出量(相当于标示量的%)。PharmaceuticalAnalysis第十八章片剂的辅料：稀释剂、润湿剂与黏合剂、崩解剂、润滑剂等含量测定：需采用样品预处理方法排除辅料干扰；以糖类稀释剂和硬脂酸镁润滑剂干扰消除为例四.含量测定PharmaceuticalAnalysis第十八章（一）糖类的干扰和消除淀粉，糊精，蔗糖，乳糖等是固体制剂稀释剂，多糖或双糖水解后产生葡萄糖及乳糖具有还原性；干扰氧化还原滴定:KMnO4法、KBrO3法等。PharmaceuticalAnalysis第十八章固体制剂润滑剂:硬脂酸镁(C17H35COO)2Mg配位常数:被测离子-EDTA>>Mg2+-EDTA，不干扰

pH6.0~7.5,酒石酸(草酸)可掩蔽。（二）硬脂酸镁的干扰和消除Mg2+干扰EDTA配位滴定；硬脂酸根干扰高氯酸非水滴定。干扰作用消除方法被测药物含量>>硬脂酸镁含量，干扰可以忽略；脂溶性有机碱性药物，碱化萃取分离后，

非水滴定。PharmaceuticalAnalysis第十八章

生物检定用分析化学基础66分析化学的定义：

研究获得物质化学组成，结构信息，分析方法及相关理论的科学。分析化学是化学中的信息科学，以降低系统的不确定度为目的。第一节分析化学概述67一、分析化学的分类1.按分析任务分类

(1)定性分析

含何种元素，何种官能团

(2)定量分析

含量

(3)结构分析

形态分析,立体结构,结构与活性68

(1)无机分析

(2)有机分析

(3)生物分析

(4)药物分析693.按数量级分类方法试样质量/mg试样体积/mL常量分析>100>10半微量分析10~1001~10微量分析0.1~100.01~1超微量分析<0.10.01703.按分析方法分类

化学分析：

1、重量分析

2、容量分析（各种滴定分析）

仪器分析：

1、

电化学分析

2、光化学分析

3、色谱分析

4、波谱分析711酸碱滴定配位滴定氧化还原滴定沉淀滴定电化学分析光化学分析色谱分析波谱分析滴定分析电导、电位、电解、库仑极谱、伏安发射、吸收，荧光、光度气相、液相、离子、超临界、薄层、毛细管电泳红外、核磁、质谱化学分析分析化学仪器分析三、分析化学的作用在化学学科发展中的作用：分子科学、遗传密码在化学研究工作中的作用：新物质鉴定结构与性能在现代化学工业中的作用：质量控制与自动检测分析化学与社会：环境、体育、破案7374第三节定量分析数据处理一、误差的种类、性质、产生的原因及减免1.系统误差

(1)特点

a.对分析结果的影响比较恒定；

b.在同一条件下，重复测定，重复出现；

c.影响准确度，不影响精密度；

d.可以消除。

产生的原因?

75(2)产生的原因

a.方法误差——选择的方法不够完善例：重量分析中沉淀的溶解损失；滴定分析中指示剂选择不当

b.仪器误差——仪器本身的缺陷例：天平两臂不等，砝码未校正；滴定管，容量瓶未校正。

c.试剂误差——所用试剂有杂质例：蒸馏水不合格；试剂纯度不够(含待测组份或干扰离子)。

d.主观误差——操作人员主观因素造成例：对指示剂颜色辨别偏深或偏浅；滴定管读数不准。76

2.偶然误差

(

1)特点

a.不恒定

b.难以校正

c.服从正态分布(统计规律)

(

2)产生的原因

a.偶然因素

b.滴定管读数

3.过失误差77二、误差的减免

1.系统误差的减免

(1)方法误差——

采用标准方法,对比实验

(2)仪器误差——

校正仪器

(3)试剂误差——

作空白实验

2.偶然误差的减免

——增加平行测定的次数78二、准确度和精密度1.准确度和精密度——分析结果的衡量指标。

(1)准确度──分析结果与真实值的接近程度

准确度的高低用误差的大小来衡量；

误差一般用绝对误差和相对误差来表示。绝对误差=测定值–真实值绝对误差相对误差=×100

真实值79(2)精密度──几次平衡测定结果相互接近程度

精密度的高低用偏差来衡量，偏差是指个别测定值与平均值之间的差值。

80（一）平均偏差

平均偏差又称算术平均偏差，用来表示一组数据的精密度。

平均偏差：

平均偏差相对平均偏差

=×100

平均值

特点：简单；

缺点：大偏差得不到应有反映。81（二）标准偏差

相对标准偏差：（变异系数）=S/X

标准偏差又称均方根偏差；有限测定次数标准偏差：

82

相对偏差与绝对偏差

a基准物：硼砂Na2B4O7·10H2OM=381

碳酸钠Na2CO3

M=106

选那一个更能使测定结果准确度高？（不考虑其他原因，只考虑称量）

b：如何确定滴定体积消耗？

0～10ml；20～25ml；40～50ml83例题用标准偏差比用平均偏差更科学更准确。

例:两组数据

(1)X-X：0.11,-0.73,0.24,0.51,-0.14,0.00,0.30,-0.21,

n=8d1=0.28s1=0.38(2)

X-X：0.18，0.26，-0.25，-0.37，0.32，-0.28，0.31，-0.27

n=8d2=0.28s2=0.29

d1=d2,

s1>s284例：水垢中Fe2O3的百分含量测定数据为(测6次)：

79.58%，79.45%，79.47%，

79.50%，79.62%，79.38%

X=79.50%s=0.09%sＸ=0.04%

则真值所处的范围为（无系统误差）：

79.50%+0.04%

数据的可信程度多大？如何确定？例题85

2、准确度和精密度的关系

精密度是保证准确度的先决条件；精密度高不一定准确度高；两者的差别主要是由于系统误差的存在。

86三、可疑数据的取舍

可疑数据的取舍

过失误差的判断，确定某个数据是否可用。方法：4d法、Q检验法1．4d法步骤：

（1）求出可疑值外数据的平均值x及平均偏差d

（2）可疑数值与平均值之差的绝对值与4d相比

|可疑数值－平均值|≥4d时，舍去。

872．Q检验法步骤：

（1）数据排列X1

X2……Xn

（2）求极差Xn

－X1

（3）求可疑数据与相邻数据之差

Xn

－Xn-1或X2－X1

（4）计算：88

（5）根据测定次数和要求的置信度，（如90%）查表：

表1--2不同置信度下，舍弃可疑数据的Q值表

测定次数Q90

Q95

Q99

3

0.940.980.994

0.760.850.93

8

0.470.540.63

（6）将Q与QX

（如Q90

）相比，若Q>QX

舍弃该数据,（过失误差造成）若Q<QX

舍弃该数据,（偶然误差所致）当数据较少时舍去一个后，应补加一个数据。89四、有效数字1．实验过程中常遇到的两类数字

（1）数目：如测定次数；倍数；系数；分数（2）测量值或计算值。数据的位数与测定准确度有关。记录的数字不仅表示数量的大小，而且要正确地反映测量的精确程度。结果绝对偏差相对偏差有效数字位数

0.51800±0.00001