《猫细小病毒实时荧光 RAA 检测方法》

ICS11.220

B41

团体标准

T/CVMAXXXXX—XXXX

猫细小病毒实时荧光RAA检测方法

Real-timeRAAmethodfordetectionoffelineparvovirus

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征求意见稿

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

（征求意见稿）

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XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

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猫细小病毒实时荧光RAA检测方法

1范围

本文件规定了猫细小病毒实时荧光RAA检测方法的要求。

本文件适用于猫细小病毒核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401—2008实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光RAAReal-timeRAA

一种重组酶介导的等温核酸快速扩增技术（简称RAA技术）。利用从细菌或真菌中获得的重组酶，

在恒温下（一般37℃~42℃），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单链DNA结

合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，

在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着

RAA反应的进行，RAA产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

3.2

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。

4符号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

RAA：重组酶介导的核酸扩增（recombinase-aidednucleicacidamplification）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

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PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）

FPV：猫细小病毒（felineparvovirus）

5试剂和材料

5.1试剂

5.1.1总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。

5.1.2PBS缓冲液（0.01mol/LPBS，pH7.4）：用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4

和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，121℃高压灭菌15min。

5.1.3DNA提取试剂盒。

5.1.4RAA反应预混液。

5.1.5引物和探针，其序列见附录A。

5.1.6RAA荧光基础反应单元：包含重组酶，单链结合蛋白，DNA聚合酶的冻干粉。

5.1.7280mmol/L乙酸镁。

5.2耗材

5.2.1带滤芯移液器吸头（规格：10µL、20µL、200µL和1000µL）。

5.2.21.5mL灭菌离心管。

5.2.30.2mLPCR光学反应管。

5.2.4冰盒（−20℃以下预冷）。

6仪器设备

6.1微量移液器（量程：0.5µL～10µL、2µL～20µL、20µL～200µL和200µL～1000µL）。

6.2冰箱（2℃～8℃和−20℃以下）。

6.3高速冷冻离心机。

6.4实时荧光PCR仪或恒温荧光基因检测仪。

7样品的采集与处理

7.1总则

实验室生物安全要求按照GB19489的规定。

7.2采样工具

非抗凝真空采血管、无菌棉拭子、5mL灭菌离心管、灭菌剪刀、组织研磨器。

7.3样品采集

7.3.1血清样品采集

用非抗凝真空采血管采集全血。

7.3.2粪便或肛拭子样品采集

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用无菌棉拭子采集猫新鲜粪便，或插入肛门转圈3~4次采集肛拭子，将拭子放入5mL灭菌离心管

中，加入2mLPBS缓冲液，浸泡20min~30min。

7.3.3肠道等组织样品采集

无菌采集猫肠道等组织样品，放入5mL灭菌离心管中。

7.4样品保存和运输

采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃~8℃下保存应不超过24h，-18℃及以

下可以稳定保存3个月，-70℃及以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下

的保存期内送达实验室。

7.5样品处理

7.5.1血清样品处理

采集的样品室温静置30min~60min，全血采用4000r/min离心5min，吸取1mL上清液至1.5mL灭

菌离心管内备用。

7.5.2粪便或肛拭子样品处理

采集的样品振荡、挤干拭子，浸泡液采用5000r/min离心10min，吸取1mL上清液至1.5mL灭

菌离心管内备用。

7.5.3肠道等组织样品处理

取1g组织样品，剪碎，加入2mLPBS缓冲液，匀浆研磨制成悬液，反复冻融3次，5000r/min

离心10min，吸取1mL上清液至1.5mL灭菌离心管内备用。

7.5.4细胞培养上清液处理

细胞培养上清液2000r/min离心5min，吸取1mL上清液至1.5mL灭菌离心管内备用。

8实时荧光RAA操作程序

8.1DNA提取

8.1.1采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的

病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于-20℃冰箱保存。

8.1.2每次抽提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品应为FPV核酸阳性样

本（血清、粪便、肛拭子、肠道等组织或细胞培养上清液）；阴性对照样品应为去离子水或者FPV核

酸阴性样本（血清、粪便、肛拭子、肠道等组织或细胞培养上清液）。

8.2实时荧光RAA检测

8.2.1反应体系的配制

在试剂配制区进行。每个样品配制43μL荧光RAA反应混合液，包括：RAA预混液25μL、正向引物

FPV-F（10μmol/L）2.1μL、反向引物FPV-R（10μmol/L）2.1μL、探针FPV-P（10μmol/L）0.6μL、去

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离子水13.2μL。将荧光RAA反应混合液加入RAA荧光基础反应单元中；将2μLDNA模板加入每个反应

管中，将5μL乙酸镁加在反应单元管盖上。每次进行荧光RAA扩增时均应设立阳性、阴性及空白对照。

阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空

白对照应用去离子水作为模板。配制反应液在冰盒中进行。

8.2.2实时荧光RAA反应程序

8.2.2.1荧光通道设置

在检测区进行。将配制好的反应液短暂离心后放入荧光PCR检测仪或恒温荧光基因检测仪中。设置

报告荧光为FAM，采用其他报告荧光应按仪器说明设定对应通道；淬灭荧光设定为None，校准荧光设

定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。

8.2.2.2循环条件设置与检测

39℃，60s，1个循环；39℃，30s，40个循环，每次循环时收集荧光信号。

8.2.3试验成立条件

8.2.3.1荧光PCR检测仪阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值

≤30.0；阴性对照无荧光对数增长，相应的无报告Ct值，试验结果有效；否则应重新进行试验。

8.2.3.2恒温荧光基因检测仪阳性对照起峰时间≤5min且出现特异性起峰曲线，阴性对照无起峰时间

或阴性对照起峰时间＞10min且无特异性起峰曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。

8.2.4结果判定

8.2.4.1符合8.2.3.1的条件，被检样品对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤30.0，

则判为FPV核酸阳性；被检样品无荧光对数增长，相应的无报告Ct值，或者Ct值>30.0，或者无典型

的扩增曲线，则判定为FPV核酸阴性。

8.2.4.2符合8.2.3.2的条件，被检样品起峰时间≤10min，且出现特异性起峰曲线，则判为FPV核酸阳

性；被检样品无起峰时间或被检样品起峰时间＞10min且无特异性起峰曲线，则判定为FPV核酸阴性。

9检测过程中防止交叉污染的措施

检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27401—2008中5.3.13的规定执行。

4

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AA

附录A

（规范性附录）

引物和探针

引物、探针的名称和序列见表A.1

表A.