《硫酸软骨素酶活性的测定》

ICS07.080

CCSA40

CBPIA

中国生化制药工业协会团体标准

T/XXXXXXX—XXXX

硫酸软骨素酶活性的测定分光光度法

Determinationoftheactivityofchondroitinase—Spectrophotometricmethod

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国生化制药工业协会发布

T/XXXXXXX—XXXX

硫酸软骨素酶活性的测定分光光度法

1范围

本文件描述了测定硫酸软骨素酶活性的分光光度法。

本文件适用于生化试剂、工业酶制剂中硫酸软骨素酶AC（ChonAC）和硫酸软骨素酶B（ChonB）

活性的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

硫酸软骨素酶活性单位chondroitinaseactivityunit

在30℃、pH7.5的条件下，每分钟产生1μmol4,5-不饱和糖醛酸所需的酶量。

注：一个酶活性单位以U表示。

4原理

硫酸软骨素与硫酸皮肤素分别为硫酸软骨素酶AC与硫酸软骨素酶B的特异性底物。硫酸软骨素酶

AC能催化底物硫酸软骨素裂解，硫酸软骨素酶B能催化底物硫酸皮肤素裂解，均会生成4,5不饱和糖醛

酸。4,5不饱和糖醛酸在232nm波长下有特征吸收，通过监测232nm下的吸光度的变化来测定4,5不饱和

糖醛酸的生成速率，计算酶活性。

5试剂

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。

5.1盐酸溶液：浓度为6mol/L。

量取500mL浓盐酸，加水稀释混匀后定容至1000mL。

5.2硫酸软骨素酶AC的反应底物溶液：含50mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、20mmol/L氯化

钙（CaCl2）、50mmol/L氯化钠（NaCl）及1g/L硫酸软骨素钠，pH7.5。

准确称取0.303gTris、0.111gCaCl2、0.146gNaCl及0.05g硫酸软骨素钠，溶解在40mL的水中，使

用盐酸溶液（5.1）调节pH至7.5后，转移至50mL容量瓶定容，充分混匀，现用现配。

5.3硫酸软骨素酶B的反应底物溶液：含50mmol/LTris、20mmol/LCaCl2、50mmol/LNaCl及1g/L

硫酸皮肤素，pH7.5。

准确称取0.303gTris、0.111gCaCl2、0.146gNaCl及0.05g硫酸皮肤素，溶解在40mL的水中，使用

盐酸溶液（5.1）调节pH至7.5后，转移至50mL容量瓶定容，充分混匀，现用现配。

6仪器设备

1

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6.1分析天平：感量为0.1mg。

6.2pH计：精度为0.01。

6.3紫外-可见分光光度计：波长精度为1nm，吸光度值精度为0.001。

6.4恒温水浴槽：精度为0.5℃。

6.5磁力搅拌器。

6.6石英比色皿：1cm。

6.7容量瓶：50mL、1000mL。

6.8烧杯：50mL、1000mL。

6.9量筒：50mL、500mL。

6.10移液器:10μL、100μL、1mL。

7试样制备和试验步骤

7.1试样酶液的制备

7.1.1液体样品待测酶液制备

移取硫酸软骨素酶液体样品溶于水中进行稀释，使待测酶液中的硫酸软骨素酶活性控制在5

U/mL～30U/mL。

7.1.2固体样品待测酶液制备

称取硫酸软骨素酶固体样品（精确至0.0001g）溶于水中，使待测酶液中的硫酸软骨素酶活性控制

在5U/mL～30U/mL。

7.2测定

准确移取1mL反应底物溶液于石英比色皿中，置于分光光度计的保温槽内，待温度稳定于30℃后，

迅速加入10μL待测酶液，加盖颠倒混匀后立即放入分光光度计，在232nm下扫描20min，保存吸光度

曲线。选取曲线平滑且线性的60s区段，通过线性回归方程计算斜率。

8试验数据处理

8.1液体样品

试样中硫酸软骨素酶活性按式（1）计算：

()××

=

×·····················································(1)

𝑉𝑉1+𝑉𝑉2𝑘𝑘𝐷𝐷

式中：𝑋𝑋1𝜀𝜀𝑉𝑉2

X1——硫酸软骨素酶活性，单位为酶活性单位每毫升（U/mL）

V1——反应底物溶液的体积，单位为微升（μL）；

V2——酶活性测定中加入酶液的体积，单位为微升（μL）；

k——酶活性测定中吸光度曲线斜率，单位为吸光度每分钟（Abs/min）；

D——稀释倍数；

ε——吸光系数，单位为mM-1cm-1（取值为3.8mM-1cm-1）。

计算结果保留三位有效数字。

8.2固体样品

试样中硫酸软骨素酶活性按式（2）计算：

()×

=×

×···················································(2)

𝑉𝑉1+𝑉𝑉2𝑘𝑘𝑉𝑉0

式中：𝑋𝑋2𝜀𝜀𝑉𝑉2m

2

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X2——硫酸软骨素酶活性，单位为酶活性单位每克（U/g）

V1——反应底物溶液的体积，单位为微升（μL）；

V2——酶活性测定中加入酶液的体积，单位为微升（μL）；

k——酶活性测定中吸光度曲线斜率，单位为吸光度每分钟（Abs/min）；

ε——吸光系数，单位为mM-1cm-1（取值为3.8mM-1cm-1）；

V0——溶解酶粉的液体体积，单位为毫升（mL）；

m——称取酶粉的质量，质量为克（g）。

计算结果保留三位有效数字。

9精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值的10%。

10试验报告

试验报告应包括下列内容：

a)试样本身必要的详细说明；