生物化学与分子生物学实验三-血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定(七年制)2015

血清γ球蛋白的

分离纯化李立胜【实验目的】1．学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析等分离纯化蛋白质的基本原理及应用2．了解蛋白质分离纯化的总体思路实验原理蛋白质分离纯化的重要意义蛋白质分离纯化的基本依据溶解度分子量等电点3分离蛋白质的方法分离方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦超速离心法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。本次实验方法一、盐析法粗分γ-球蛋白分离依据：溶解度二、凝胶过滤方法脱盐分离依据：分子量三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白分离依据：等电点5定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理:

破坏蛋白质两个稳定因素：

水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。优点：蛋白质不变性，常用。实验一、盐析法盐析法粗分γ-球蛋白分离依据：不同蛋白在高浓度中性盐溶液中溶解度不同半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出7盐析步骤取离心管一支加入血清2ml加入2ml0.9%氯化钠摇匀边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO44ml上清液（主要含清蛋白）倾去静置10min，再离心（5000转/分）10min沉淀用1ml0.9%氯化钠搅拌溶解逐滴加饱和(NH4)2SO42ml,摇匀静置10min，再离心（5000转/分）10min倾弃上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白加入0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH=6.3)1ml溶解γ－球蛋白粗提液实验二、葡聚糖凝胶柱层析（P31）原理:按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。9葡聚糖凝胶柱层析脱盐

本试验采用葡聚糖凝胶——SephadexG25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。▲SephadexG-25的准备▲装柱（15~20cm）操作步骤：1、层析柱保持垂直。2、放蒸馏水，排出空气，关闭出口。3、加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，静止2分钟，调节流速10滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。4、上留1-2mm的液体，关闭出口。

注意：★柱床面上要保持少许液体，防止胶床露出液面。

★胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。▲加样与洗脱1、加样：用滴管将盐析后样品缓缓地加入柱床面，打开出口使样品溶液渗入凝胶，并用少量洗脱液清洗。2、洗脱：缓缓地加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收集洗脱液，每管收集15滴。注意柱床面不要干燥。3、检测：20%璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质，并用奈氏试剂检测NH4+，保存含量高且无NH4+的进一步纯化▲凝胶的再生

不断加洗脱液，使NH4+全部流出，为下次实验做准备脱盐

12345678910②上样γ－球蛋白，粗提液①装柱葡聚糖凝胶G-25，柱高18-20cm流速：每分钟10滴左右

③加入洗脱剂④收集15滴换一支试管▲层析后洗脱液检测白色比色板和载玻片,洗净备用。白色比色板各个样品滴加奈氏试剂（检测NH4+）,载玻片各个样品滴加20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。用“-”表示无现象，用“+”,“++”,“+++”等表示颜色深浅▲

回收凝胶注意事项：

1.凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏。

2.加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。★

以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果。

离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。

DEAE（二乙基氨基乙基）－纤维素含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂。离子交换剂类型带电荷吸附离子阳离子交换剂负电阳离子阴离子交换剂正电阴离子实验三、DEAE－纤维素离子交换层析(P34)

蛋白质的电离示意图

血清中蛋白的等电点18清蛋白α2球蛋白

β球蛋白γ球蛋白等电点pI4.645.065.127.3pH=6.3负电负电负电正电操作装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析。用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是γ－球蛋白。实验四、γ－球蛋白纯化液的浓缩

利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白。

每ml纯化γ－球蛋白溶液加SephadexG-250.25g，摇动2～3分钟，离心3000r/min，5分钟，上清即为浓缩γ-球蛋白注意事项211.装柱时检查是否漏水。2.装柱后凝胶