《类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范（征求意见稿）》编制说明

地方标准编制说明一、目的意义1）开展化学物质健康风险评估是国家发展的重要需求出积极推进将健康融入所有政策；有效识别环境中的健康有害因素、开展精准预防，是最经济、有效的健康策略。近年来，随着经济飞速发展，以化学物污染为主的环境危害问题日益突出。据统计，仅2017年，环境有害因素导致我国死亡人数分别为：不良膳食风险因素310万、烟草250万、空而许多环境因素的健康危害是可以预防和控制的。2022年，国务院办公厅印发了《新污染物治理行动方案》，明确指出，“要研究制定化学物质环境风险筛查和评估方案，开展环境与健康危害测试和风险筛查”。因此，开展化学物质的环境暴露健康风险评估尤为重要。长期以来，传统的毒性测试主要通过对实验动物（主要是啮齿类动物）进行不同途径、不同期限的染毒并检测各种毒性终点的试验，从而确定无害作用水平（NoObservedAdverseEffectLevel,NOAEL）、毒性类型、靶器官、剂量反应关系。然而常规的毒性测试方法的耗时长、人力物力消耗巨大及由外推不确定性的局限性导致其在面对当前日益严峻的环境化学物毒—2—性测试评价中难以为继，因此从3R原则到2007年美国国家研究委员会发布的《21世纪毒性测试：愿景与策略》（ToxicityTestinginthe21stCentury:AVisionandaStrategy这不仅是对实验动物福利的考虑，更是说明我们应该提出全新的毒理学研究思路与毒性测试方法，从整体动物实验为基础逐渐转向细胞体外测试与计算毒理相结合。在此背景下，我们可以利用构效关系模型QSAR（quantitativestructure-activityrelationship）对化合物的毒性进行预测和评估；基于生理的药代动力学模型（physiologicallybasedpharmacokineticmodelling,PBPK）则可以较好的实现高剂量到低计量的外推和预测化学在体内的分布浓度。为实现该报告中的目标，美国毒环保署（EPA）的Toxcast和Tox21项目，旨在对成千上万的化学物进行高通量体外试验，获取高质量、高精度毒性通路扰动数据，同时建立公共数据库，开发基于高通量实验数据的计算毒理学评估方法，为化学品毒性识别、风险评估和AOP发展提供了扎实的基础和巨大的便利。此外新的毒性测试方法也在不断涌现，如高通量体外筛选、细胞成像技术和高内涵筛选、组学方法（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学）、生物信息学和可视化工具（如GeneSpring）、计算毒理学等，这些方法的提出和综合应用将大大减少化合物安全评估的成本和时间，显著减少或尽可能避免大量的动物实验。然而，上述新的毒性测试方法获得的体外数—3—据大多基于单个细胞系的研究，未能完全考虑到组织内多个细胞的相互作用和影响。2）类器官在化学品毒性测试中的优势毒理学测试，先后经历了2D单层细胞培养、细胞球模型和类器官模型。2D细胞培养和细胞球模型常用单一的特定细胞系，与体内多细胞组织及其生理功能差异较大。所谓类器官(organoid)，指的是由诱导多能干细胞、胚胎干细胞或成体干细胞在体外自组织并经历一定程度的细胞分化形成的3D结构，具备体内组织器官的部分典型功能，具有较为稳定的表型和遗传学特性。器官模型可模拟组织器官的复杂空间形态，突破了细胞间单纯的物理接触和联系，表现出细胞间和细胞-基质相互作用，与体内组织器官具有更相似的生理反应。类器官模型与2D单层细胞模型或细胞球模型相比，能更好地用于模拟器官组织的发育过程及生理病理状态，因而能更好地反映体内毒性效应。综上所述，类器官在毒性测试中的包括以下优势：a)更接近人体：类器官的组织结构和功能与人体器官相似，因此更接近人体反应，可以更准确地预测毒性。b)更快速：因类器官可在较短时间内模拟器官的生长发育，因此可更快地获得毒性测试结果。c)更经济：使用类器官进行毒性测试比使用动物进行测试更d)更可靠：因在在相同的环境下使用类器官进行毒性测试，—4—因此可减少测试结果的变异性。e)更易推广：使用类器官开展毒性测试，可大幅度减少实验动物的使用，更符合“3R”原则，因此更易推广。3）建立类器官在化学品毒性测试中的技术规范标准的必类器官模型构建方法的改进及其标准化是类器官毒理学研究的根本任务。尽管类器官在模拟体内器官形态和功能上相比2D细胞模型有了极大的提升，但和体内组织器官的成熟度和复杂性仍有较大差距。在类器官的培养过程中，随着细胞的大小和体积的增加，简单扩散过程使得为核心部分细胞提供的氧气和营养不足，核心部分细胞代谢废物排出也受到限制。类器官通常缺乏基底、组织驻留免疫细胞和血管，限制了类器官的发育和成熟。此外，类器官变化迅速，在不同培养阶段所需培养条件不同。优化细胞组合类型、培养基组成以及结合微流控技术等有望改善类器官模型的功能。类器官的尺寸和细胞组成变异性较大，构建方法标准化有助于改善毒理学评价结果的重现性和准确性。为满足化学品毒理学评价的巨大需求，高产量构建方法是类器官毒理学的基本要求。因此，建立类器官在化学品毒性测试中的技术规范标准的十分迫切且很有必要。二、任务来源江苏省地方标准《类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范》由江苏省市场监督管理局于2023年7月份批准立项（苏市监标[2023]24号）。本地方标准由南京医科大学提出，主要起草单位有南京医科大学、同济大学附属东方医院、苏州市疾病预防控制中心。三、编制过程2023年7月，江苏省市场监督管理局同意《类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范》立项。项目团队2023年8月召开研讨会，对该标准的立项背景、编制目的、意义以及标准中涉及的技术要求等相关内容进行了详细介绍，项目团队对初稿进行了深入的交流和讨论，进一步明确了该项标准编制方向，规范了标准编写格式。2023年8月团队开展标准实验和制定工作，包括脑、心、肺、肠、肝类器官的构建和毒性评价方法的建立。2023年11月，项目团队外请20位专家征求该标准意见，情况如下：①发送“征求意见稿”的单位/专家数20个，收到“征求意见稿”后，回函的单位/专家数20个，收到“征求意见稿”后，回函并有建议的单位/专家数20个，提出意见20条；②通过互联网征集意见0条；③通过研讨会、专家咨询会征求意见0条；共收到意见34条，其中采纳29条，部分采纳2条，不采纳3条；最终形成标准预审稿。2024年4月，本标准在江苏省疾病预防控制中心召开预审会，预审专家包括朱宝立（江苏省疾病预防控制中心）、倪春辉（南京医科大学康达学院）、张婷（东南大学）、卞倩（江苏省疾病预防控制中心）、徐酩（江苏省疾病预防控制中心）及江苏省卫生健康标委会秘书长杨丹丹、江苏省卫生健康标委会秘书徐佳南等。与会专家对本标准内容高度认可，并提出了中肯的修改意见。项目起草团队对专家意见进行了逐一答复和修改。2024年6月-9月，组织3家有资质的实验室进行验证。根据影响方法的精密度和准确度的主要因素和数理统计学的要求，编制方法验证报告，验证数据主要包括检出限、测定下限、精密度以及加标回收率等。验证单位及验证人员信息如下：江苏卫生健康职业学院（王莉）、江苏雅信昆成检测科技有限公司四、主要内容本标准规定了类器官（心、脑、肺、肝、肠）在化学品毒性测试中的技术规范。本标准适用于评价各类化学物对相应组织系统的实验原理、试剂耗材、仪器设备、试验方法和类器官毒性测试评价。本标准规定了类器官（脑、心、肺、肠、肝）在化学品毒性测试中的应用技术规范。本标准适用于开展各类化学品对相应组织器官来源的类器官的毒性测试。2.规范性引用文件—7—下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3.术语和定义类器官（organoid由干细胞或前体细胞体外培养形成，由组织器官特异性的多种细胞组成，具有特定组织器官关键结构和功能特性的三维细胞培养物。毒性测试（toxicitytesting给受试物进行不同途径、不同时间的染毒，检测各种毒性终点的实验。4.实验原理通过构建脑、心、肺、肠、肝类器官，检测化学品处理下，类器官各指标的变化情况，以反映化学品相应靶器官毒性大小。5.试剂和耗材5.1试验中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂；所使用的水，在未说明规格时，应符合GB/T6682中纯水的规定。5.2试剂和耗材宜包括但不限于：Essential6™培养基、Neurobasal™-A培养基、小鼠肺类器官培养基、小鼠肠类器官培养基、小鼠肝类器官培养基、TeSR™E8™培养基、B27培养基；b）Matrigel基质胶；c）Accutase消化液、EDTA溶液；d）胎牛血清（FBS生素A）、成纤维细胞生长因子2（FibroblastGrowth蛋白4（BMP4）、6-[[2-[[4-（2，4-二氯苯基）-5-（5-甲基-1H-咪唑-2-基）-2-嘧啶]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈肝素、成纤维细胞生长因子9（FGF9）、4-[4-（1,3-苯并二氧杂环戊醇-5-基）-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰Wnt-C59；g）磷酸盐缓冲液（PBS）、红细胞裂解液、DNA酶溶液；粘附孔板、细胞培养皿、transwell小室。—9—6.仪器设备仪器设备至少应包括：a）生物安全柜；b）激光共聚焦显微镜；d）细胞培养箱；f）倒置显微镜；g）移液枪；h）无菌细胞培养皿；i）多功能酶标仪；j）医用冰箱。7.试验方法（类器官构建、类器官毒性测试评价）7.1类器官构建7.1.1脑类器官构建7.1.1.1脑类器官宜采用人胚胎干细胞H9构建，培养于37℃5%CO2培养箱中，通过定向分化为背侧前脑类器官。7.1.1.2当H9干细胞生长汇合度约80%~90%后，用0.5mMEDTA溶液消化为单细胞，用含有10μMY27632的细胞的悬液转移至Elplasia96孔板中（Elplasia96孔板需提前加入含有10μMY27632的PGM1多能干细胞培养基以500g×3min进行离心浸润，排除微孔底部的空气）。7.1.1.3将孔板放入细胞培养箱中静置6~12h后，观察到干细胞形成边缘光滑的球体后，转移到低粘附的6孔板中。7.1.1.4Day0~6背侧前脑类器官形成：将培养基替换为预热的dorsomorphin、2.5μMXAV-939、1%青霉素/链霉素每孔2mL液体，前两天维持稳定不更换培养基，后面每天换液。7.1.1.5D6~25背侧前脑类器官扩增：将培养基替换为预热的Neurobasal™-A培养基（含1%10050×B27、1%青霉素/链霉素、20ng/mLEGF、20ng/mLFGF2），每孔2mL液体，前10天每天更换培养基液，后面九天隔天更换培养基。7.1.1.6D25~D43背侧前脑类器官分化：将培养基替换为预热的Neurobasal™-A培养基（含1%10050×B27、1%青霉素/链霉素、20ng/mLBDNF、20ng/mLNT3），每孔2mL液体，隔天换液。7.1.1.7D44~:背侧前脑类器官维持：将培养基替换为预热的Neurobasal™-A培养基（含1%10050×B27、1%青霉素/链霉素），每孔2mL液体，3~4天换液。7.1.2心脏类器官构建7.1.2.1心脏类器官宜采用人胚胎干细胞H9构建，培养于37℃5%CO2培养箱中。7.1.2.2使用Accutase消化液将H9细胞解离成单细胞并进行计然后以10000细胞/孔的量，将细胞接种到低吸附处理的96孔板中，300g离心4min。7.1.2.324h后（记为Day-1更换不含Y27632的TeSR™E8™培养基24小时。7.1.2.4Day0使用含有1ng/mLActivinA、1.25ng/mLBMP-4、47.1.2.5Day1更换B27培养基（不含胰岛素）24h。7.1.2.6Day2利用含有2μMWnt-C59的B27培养基（不含胰岛素）培养2d。7.1.2.7Day4更换B27培养基（不含胰岛素）继续培养2d。7.1.2.8Day6更换B27培养基培养24h。7.1.2.9Day7用2μMCHIR-99021的B27培养基处理1小时；7.1.3肺类器官构建7.1.3.1肺类器官宜采用小鼠肺组织构建，置于37℃5%CO2培养箱中培养。7.1.3.2将小鼠用75%酒精彻底消毒皮肤，无菌分离肺组织并置于预冷的无菌PBS溶液中漂洗，清除结缔组织及肺内主支气管，分离肺叶，清洗2次～3次去血。7.1.3.3无菌镊子转移清洗后的肺叶于新的培养皿中，吸除残留的PBS，用眼科手术剪将肺组织均匀剪成约1mm3的组织块，转移至预热的胶原酶消化溶液中，37℃恒温摇床（100转r/min）消化45min～60min。7.1.3.4加入等量的含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F127.1.3.5加入3mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温孵育1min~25min，弃上清；重复上述步骤2次，直至细7.1.3.6加入4mLDNA酶溶液（20U/mL）重悬细胞沉淀，室温手摇3min～5min；加入6mLDMEM/F12培养基混匀，7.1.3.7按照2×107/mL细胞数量重悬于40μLMatrigel基质胶中，并接种至24孔板中央。7.1.3.8待Matrigel基质胶凝固后，加入600μL小鼠肺类器官培养基，每隔2d天更换培养基，第14d即得到肺类器官。7.1.4肠类器官构建7.1.4.1肠类器官宜采用小鼠肠组织构建，置于37℃5%CO2培养箱中培养。7.1.4.2在靠近小鼠胃的一端取长度约20cm小肠，去除肠道绒毛、血管和脂肪。7.1.4.3将肠段纵向切开，用预冷的PBS轻轻洗涤肠道，直至清洗干净。7.1.4.4将肠组织剪成2mm片段，用预冷的PBS反复冲洗，直至上清液澄清。7.1.4.5除去上清液，将组织碎片重悬于4mL含有5mMEDTA7.1.4.6用枪头吹打、重悬含有消化液的组织碎片，使组织反复穿过移液管以产生机械剪切力，从而使肠隐窝与基底层7.1.4.7加入4mL小鼠肠类器官培养基终止消化。7.1.4.8用100μm细胞筛过滤组织悬液，过滤液4℃300g离心5min，弃上清。7.1.4.9显微镜下计数肠隐窝数量。7.1.4.10按照每10μLMatrigel基质胶含200个～600个肠隐窝密度，接种至24孔板中。7.1.4.11待Matrigel基质胶凝固后，加入600μL小鼠肠类器官7.1.5肝类器官构建7.1.5.1肝类器官宜采用小鼠肝组织构建，置于37℃5%CO2培养箱中培养。7.1.5.2取小鼠肝脏，放入预冷的DMEM/F12培养基中漂洗2次。7.1.5.3使用无菌剪刀将肝脏剪碎至1mm3大小，转移至离心管中，静置2min后，去除上清。7.1.5.4放入消化液10mL（Dispase、IV型胶原酶、DMEM/F12），7.1.5.5机械吹打后，静置1min，去除上清。7.1.5.6上述步骤重复3次，收集上清液，冰上保存。7.1.5.7用70μm细胞筛过滤组织悬液，收集过滤液。7.1.5.8用30μm细胞筛过滤，收集细胞筛网截留的肝细胞。7.1.5.9按照2×107/mL细胞数量重悬于40μLMatrigel基质胶中，并接种至24孔板中央。7.1.5.10待Matrigel基质胶凝固后，加入600μL小鼠肝类器官培养基，每隔2d更换培养基，第14d即得到肝类器官。类器官毒性测试评价评价方法采用类器官培养基，将受试化学品按一定比例（推荐1：4）逐级稀释，生成具有梯度浓度的稀释液。小心吸出培养皿中培养基（不要触碰胶滴加入含受试化学品的培养基进行培养。根据类器官种类不同，检测相应的指标，以反映化学品对类器官毒性的大小。7.2评价指标7.2.1脑类器官检测指标应包括但不限于下列内容。a)类器官生长速率。b)检测脑类器官标志物表达水平，包括：1)神经元标志物，如微管相关蛋白2（MAP2）；2)胶质细胞标志物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。7.2.2心脏类器官检测指标应包括但不限于下列内容。a)类器官生长速率。b)检测心类器官标志物表达水平，包括：1)肌成纤维细胞，如钙调蛋白（calponin2)内皮细胞，如血小板内皮细胞粘附分子-1（CD31）、VE-7.2.3肺类器官检测指标应包括但不限于下列内容。a)类器官生长速率。b)检测肺类器官分子标志物变化水平，包括：1)上皮标志物，如上皮细胞粘附分子（EpCAM）；2)增殖标志物，如Ki-67；3)分化标志物，如AcetylatedTubulin。7.2.4肠类器官检测指标应包括但不限于下列内容。a)类器官生长速率。b)检测肠类器官分子标志物变化水平，包括：1)杯状细胞，如黏蛋白2（Muc2）；2)潘氏细胞，如溶菌酶（Lyz）；3)吸收细胞，如钙调肌动蛋白（Villin）。7.2.5肝类器官检测指标应包括但不限于下列内容。a)类器官生长速率。b)检测肝类器官分子标志物变化水平，包括：）；2)甲胎蛋白（AFP）；3)细胞角蛋白19（CK19）。五、技术指标确定的依据贯彻国家的法律、法规、方针、政策及国家、行业地方强制性标准。积极采取国家、行业、地方推荐性标准；企业内部标准有在确定必要时才能制定，避免没有实际意义的要求形成2.可行性：全世界每天新增约26万种新化学物，绝大多数化学物未经过毒理学安全评价就应用到生产生活中，并可通过多种途径进入人体，增加人群健康风险。据世界卫生组织数据统计，每年因环境污染导致的死亡人数超1400000人。因此，亟需开展化学物对健康危害评估，以较好地识别高危高毒性化学物，保护我国人民健康。类器官因具有天然的组织同源性及结构功能相似性，建立标准化的类器官构建方法和相应的毒性测试流程具有较大的市场潜能。六、重大分歧意见的处理过程和依据七、与相关法律法规和国家标准的关系标准符合相关法律法规要求，目前尚无相关国家标准技术。八、推广实施建议脑、肺、肝、肠）在化学品毒性测试中的技术规范。九、起草单位和起草人员信息及分工9.1起草单位信息南京医科大学：南京医科大学是国家“双一流”建设高校，首批教育部、国家卫生健康委与江苏省人民政府共建医学院校，教育部高水平公共卫生学院建设高校，江苏高水平大学建设高峰计划A类建设高校；学校拥有国家重点学科3个、国家重点（培育）学科1个、国家临床重点专科34个、江苏高校优势学科（四期）6个。在新一轮全国学科评估中整体实力稳中有进；13个学科位列ESI全球排名前1%，其中，临床医学学科、药理学与毒理学学科位列ESI全球排名前1‰。学校建有生殖医学与子代健康全国重点实验室、环境与人类健康国际联合研究中心、肿瘤个体化医学省部共建协同创新中心等30多个国家级、省部级重点实验室（工程研究中心、创新中心）。拥有国内一流的医学模拟教育中心和江苏省医药动物实验基地，建有省内唯一的省级卫生政策智库—江苏省健康研究院。学校积极面向生命健康领域的国家重大需求，组建了基础科学中心、创新研究群体等重大科技创新团队；承担各类重大、重点国家科技计划项目近百项；代表性研究成果在《自然》《科学》等顶级学术期刊发表，获得了以国家自然科学二等奖为代表的一批国家级和省部级科研成果奖项。同济大学附属东方医院：始建于1920年，是一个集医疗、教学和科研于一体的大型三级甲等综合性医院，全国文明单位，2023年入选上海公立医院党建工作“示范医院”创建单位。东南大学：东南大学现有36个院系、90个本科专业，有有10个博士专业学位授权点类别、30个硕士专业学位授权点类别。有全日制在校生40220人，其中本科生16931人，研究生建有四牌楼、九龙湖、丁家桥等校区，占地面积5888亩，其中九龙湖校区3752.35亩，总建筑面积约90.89万平方米。学校图书馆面积6.69万平方米，藏有各类纸本图书资料478万册，可访问数据库检索平台149个（二级数据库234个）。学校还设有无锡校区和苏州校区。东南大学是一所以工科为主要