DB51T 2966-2022 濒危野生植物及其制品物种鉴定规范

CCSB00DB512022-12-27发布I 1范围 1 13术语和定义 14缩略语 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 310样品鉴定 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 511.2新方法的使用 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1濒危野生植物及其制品物种鉴定规范GB/T6682分析实验室用水规格GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化GB/T27025检测和校准实验室能力的通用GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学LY/T2501野生动物及其产品的物种SN/T3689植物检疫性有害生物实验室生物SN/T4626DNA条形码物种濒危野生植物endangeredwi濒危野生植物制品endangeredwildplant2委托单位(人)提供的、用作物种鉴定的濒危野生植物及其产品。对照control用一组或一类已知样品用于濒危野生植物及其产品鉴定的有效性和准4缩略语BOLD:生命条形码数据系统(TheBarcodeofLifeDataSystem)CITES:濒危野生动植物种国际贸易公约(theConventiononInternationalTradeinEndangeredSpeciesofWildFaunaandFlo5物种鉴定指标5.1宏观形态学指标以物种典型或特异的形态特征作为鉴定指标(参见中国植物志)。5.2微观形态学指标根据种子、花、等组织的典型或特异性的微观5.3生物化学指标6物种鉴定原则6.1根据具体案(事)件缩小目标物种的范围、确定适用的检验鉴定方法。6.2形态特征完整、物种特征鲜明的检测样品，采用宏观形态学方法进行检验鉴定。6.3具有物种特异性的微观结构特征的检测样品，采用微观形态学方法进行检验。6.4具有物种特异性生化成分的检测样品，可采用生物化学方法进行检验鉴定。6.5采用宏观形态学方法无法进行物种鉴定(但能够提取DNA的检测样品)可采用生化和分子生物学方法进行检验鉴定。6.6宏观形态学方法中具有物种唯一性的特征指标可以单独使用，如指标特征不具有物种唯一性，则应联合使用2个以上指标做出鉴定结论。7.1仪器7.1.1实验室应配置与其所应用的检验方法所必需的仪器设备，且应是具有资质的实验仪器设备厂家37.1.2检验方法所必需的关键(核心)设备所产生的数据或结果应能够被同行认可。7.1.4新购置的仪器设备、或原有仪器设备维修保养后，在使用前应当校准或测试。7.2.1实验室应配置与其所应用的检验方法所必需的实验耗材和试剂，且应是具有资质的厂家生产的7.2.2所有实验耗材和试剂应处于保质期或有效期内。7.2.3商品试剂盒应标明到货日期和有效期。实验室自行配制的试剂应在容器上标明名称、浓度、配7.2.4每一批次购进的耗材和试剂应进行符合性验证等质控检验。8实验室区域设置8.1实验室基本要求8.1.1实验室应设立完善的组织机构、质量保障和管理体系。8.1.2实验室的各功能分区应布局合理，通风良好、光线适度、设备完善，达到检验鉴定的要求。8.1.3配备生物安全设施，确保环境不受濒危野生植物携带病原的污染。区域设置应符合实验流程，避免实验过程中检测样品和宏观形态学检验、微观形态学检验、生物化学检验和分子生物学检验应分别设置检验区域。微观形态学检验室和生物化学检验室应分别设置样品制备和检验两个基本区域。检测样品贮存室：主要用于送检测样品料的妥善保管和贮存。初检室：主要用于案件的登记、检测样品的初检和照相、录相、固定等。试剂贮存和配制室：主要用于试剂的贮存、配制、消耗品的消毒等。数据分析室：主要用于检验结果的分析、比对、鉴定报告的形成等。档案室：主要用于案件资料、实验操作相关资料的存档保存等。9人员要求及管理9.1工作人员包实验室负责人、技术负责人、质量负责人、鉴定人和鉴定助理等应遵守国家有关法律法规，诚实守信，有良好的职业道德操守，严格遵守行业主管49.2技术负责人应具备博士学位或中级以上专业技术职称，相关专业，五年以上相关工作经验，具备9.3鉴定人应具备生物学、分子生物学与生物化学相关专业背景，在相关实验室工作一年以上，并通9.4鉴定助理应具备相关专业背景，具有6个月以上相关技术培训的经历。9.5必要时，技术负责人和鉴定人按照有关要求有配合相关部门履行结果解释和出庭义务。10.1.1鉴定受理应由专门人员负责，受理及特征、鉴定要求等基本情况，并进行检测样品的交接、拍照或录像存档。10.1.4检验鉴定如需对检测样品进行破坏性取样而严重改变其原有价值的，应征得委托单位同意。10.1.5无法鉴定的，经技术主管同意检测样品应分别存放；转移检测样品或使用时经手人应签名。10.3.4分子生物学方法(见附录A)PCR扩增严格设置阳性(巳知的DNA样品)和阴性(不加DNA的空白)对照。5DB51/T2966—2022用于序列测定。PCR产物纯化和测序可分包给已获认可的权威专业技检验鉴定结束后，除留存备份样品以外，剩余的检测样品返还委托单位。变质和超过保留时限的检测样品应及时告知委托单位。携带疫病的检测样品应进行无害化处理。10.4结果分析10.6鉴定的复核对鉴定结果不明确或其他特殊需要，按有关程序经同10.7鉴定质量控制术负责人应与鉴定人一起对影响鉴定的各个环节(包括样品、仪器、试剂、分等)逐一排查，确定问题来源，并整改。整改应有记录，并存档。形成明确鉴定结论的，起草鉴定报告。报告应有一定的格式(可参照有关标准)。鉴定人对鉴定结技术负责人负责鉴定报告内容的审核，实验室负责人负责鉴定报告的签发611.1.1有选定的标准样品。11.1.2灵敏度检验：确定能可靠鉴定所需的最小样本量。11.1.3物种群体遗传学调查适用性。11.1.4具有特异性、适用性、稳定性或通用性。11.1.5PCR及相关检验方法的认可见GA/T382。11.2新方法的使用在现有方法无法解决的情况下，需采用新方法进行检验鉴定时，应由同行专家组成的专家组认可。11.3标准方法确认11.3.1根据检测样品的需要和实验室的实际情况优先选择使用标准方法。11.3.2实验室在采用标准方法之前，应对实验室能否正确执行该标准方法进行确认。具体确认要求按GB/T27025执行。11.3.3如实验室采用的标准方法发生了改变，实验室应重新进行确认。11.4非标方法确认非标方法包括各部委下发的技术文件、其他实验室采用、权威刊物发表和实验室自行研制的尚未形成标准的鉴定方法。非标方法应符合GB/T17401要求。实验室在没有标准方法或现有标准方法无法完成鉴定的情况下可考虑采用非标方法，但必须经过如下验证确认。其他实验室采用、权威刊物发表非标方法须经至少3家实验室联合验证确认。实验室自行研制的鉴定方法须经同行专家组成的专家组审核，并经至少3家实验室联合验证确认。12档案资料12.1.1登记资料：包括受理记录、送检单位的委托证明材料、检测样品照片、检测样品保管或返回记录、检验中交接记录、鉴定文书的发放记录等。12.1.2检验记录资料：根据不同检验方法所需要的不同资料，如形态学的各种量度、检验记录，生化检验的实验记录，分子生物学的DNA提取记录、PCR反应记录、电泳检验记录、测序结果、数据处理12.1.3图谱图片：包括扫描电镜照片、显微镜照片、仪器分析图表、普通相机照片、自显影图、干燥胶等。12.1.4鉴定文件：包括鉴定意见书或检验报告、检验结果图谱等。12.2操作手册12.2.1实验方法类：植物及其器官的制备方法及程序；扫描电镜样品的制备方法及程序；特殊成分的生化检验方法；各种DNA提取方法、DNA定量方法、检验方法和各种物种鉴定方法及程序等。12.2.2仪器操作类：各种仪器的操作使用方法、维护方法。12.2.3试剂配制类：各种试剂的配制方法、贮存方法。12.3说明书类重要仪器设备说明书、特殊试剂盒操作说明书、特殊试剂说明书等应留档备查。7DB51/T2966—202212.6其他资料13.1检测样品13.1.1取样时，根据样品特点，应取深层组织、或清13.1.2各样品应标记清楚，防止各样品间的混淆、以13.2.1检验人员应严格按检验规程操作。13.2.2进人实验室应穿实验室工作服和工作鞋。13.2.3检验操作中应戴一次性手套，一旦手13.2.4根据检验的需要应戴实验室专用帽子、口罩和防13.3.1检验开始前应用75%乙醇将工作台擦洗干净，检验结束后用10%次氯酸钠再擦洗所有的工作台13.3.2检验室应定期清洁并进行紫外灯照射消毒。13.3.3PCR区域应使用专用清洁工具。13.4.1各区域应配置专用的移液器、试剂架等，不应拿到其他13.4.2试管使用前应高压灭菌。13.4.3可高压灭菌的移液器等在使用前应高压灭菌；无法高压灭菌的应定期用75%乙醇和纯水清洗，8DB51/T2966—202213.5.2应使用一次性移液吸头。13.5.4分子生物学检验应设置阳性和阴性对照。14档案资料14.2.1化学药品应标记清楚，应有专门存放程序和记录。14.2.2化学药品的弃置应按专门程序进行，并备详细记录。14.2.3特殊药品使用前应有专门培训。14.3.1仪器操作说明中应注明该仪器操作中发生事故或故障的可能性及原因，并注明预防和处理的14.3.2应按规定对仪器定期进行检查、保养。14.4.1检验人员必须认真学习检验规程和有关的安全技术规程。14.4.2在使用前应了解化学药品的毒14.4.3在使用前应了解设备性能及操作中可能发生事故的原因，掌握预防和处理事故14.4.4接收样品及处理各环节需要按照一级以上防护。14.4.5检验室内禁止吸烟、进食，严禁用试验器皿处理食物。14.4.6离开检验室前用清洁用品洗手。14.5.1样品接收后再紫外照射30min以上再进行实验室间传递。疫病的传染、传播。取样可按照SN/T3689进行植物检疫性有害生物实验室生物安全操作规范14.5.3废弃物处置、电气设备、放火、紫外光源和激光光源按照GB19489的相关规定执行。15.1建立国内外濒危植物鉴定实验室间合作机制。15.4与技术先进的研究机构和犯罪调查专家合作开展能力建设和培训。9对参与鉴定过程的鉴定工作人员进行培训，以不断提高鉴定人员的技术能A.1概述对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同顺序排成，因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。DNA条形码分子鉴定通常是选用A.2仪器的一般要求动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段中碱基顺序或大小，以及定量A.3.1检测样品处理psbA-trnH序列扩增正向引物psbAF：5´-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3´;反向引物trnHR：5´-A.3.3.2反应体系A.3.3.3扩增程序采取1%琼脂糖，100V，电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位切取目的条带所在位置的在紫外灯下迅速凝胶,采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化。使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序,PCR扩增引物作为测序引物,测序原理同Sanger测序法。有目的条带的序列拼接对双向测序峰图应用有序列拼接功能的专业软件进行序列拼接,去除引物序列质量与方向为确保DNA条形码序列的可靠性,需去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域,序列方将获得的序列与NCBI及BOLD中DNA条形码标准小花龙舌兰(姬乱雪)Agaveparviflora皇后龙舌兰Agavevictoriae-reginae#4间型酒瓶兰Nolinainterrata克雷塔罗丝兰YuccaqueretaroensisGalanthusspp.Sternbergiaspp.德氏漆Operculicaryadecaryi织冠漆Operculicaryahyphaenoides象腿漆Operculicaryapachypus安博棒锤树Pachypodiumambongense巴氏棒锤树Pachypodiumbaronii德氏棒锤树PachypodiumdecaryiHoodiaspp.★蛇根木(印度萝芙木)Rauvolfiaserpentina★人参Panaxginseng(仅俄罗西洋参Panaxquinquefolius智利南洋杉AraucariaaraucanaBeaucarneaspp.★桃儿七Podophyllumhexandrum哈氏老人须Tillandsiaharrisii卡氏老人须Tillandsiakammii旱生老人须Tillandsiaxerographica岩牡丹属所有种Ariocarpusspp.星冠Astrophytumasterias花笼Aztekiumritteri精美球Coryphanthawerdermannii林氏鹿角掌Echinocereusferreirianusssp.lindsayorum珠毛柱Echinocereusschmollii小极光球Escobariaminima须弥山Escobariasneedii白斜子Mammillariapectinifera(包括亚种solisioides)圆锥花座球Melocactusconoideus晚刺花座球Melocactusdeinacanthus苍白花座球Melocactusglaucescens疏刺花座球Melocactuspaucispinus帝冠Obregoniadenegrii金毛翁Pachycereusmilitaris布氏月华玉Pediocactusbradyi银河玉Pediocactusknowltonii雏鹭球Pediocactusparadinei斑鸠球Pediocactuspeeblesianus天狼Pediocactussileri斧突球属所有种Pelecyphoraspp.布氏白虹山Sclerocactusblainei麒麟属所有种Pereskiaspp.、Pereskiopsisspp.和顶花掌属所有种Quiabentiaspp.)突氏玄武玉Sclerocactusbrevihamatusssp.tobuschii短刺白虹山Sclerocactusbrevispinus新墨西哥鯱玉Sclerocactuscloverae白琅玉Sclerocactuserectocentrus苍白玉Sclerocactusglaucus藤荣球Sclerocactusmariposensis月想曲Sclerocactusmesae-verdae尼氏鯱玉Sclerocactusnyensis月童Sclerocactuspapyracanthus毛刺球Sclerocactuspubispinus塞氏鯱玉Sclerocactussileri犹他球Sclerocactuswetlandicus怀氏虹山Sclerocactuswrightiae鳞茎玉属所有种Strombocactusspp.姣丽球属所有种Turbinicarpusspp.尤伯球属所有种Uebelmanniaspp.多柱树Caryocarcostaricense云木香Saussureacostus柔毛沙葫芦Zygosicyospubescens沙葫芦Zygosicyostripartitus智利肖柏Fitzroyacupressoides姆兰杰南非柏Widdringtoniawhytei★桫椤属所有种Cyatheaspp.印度苏铁Cycasbeddomei★金毛狗脊Cibotiumbarometzdeltoidea捕蝇草Dionaeamuscipula安波沃本大戟(安波麒麟)Euphorbiaambovombensis开塞恩坦马里大戟Euphorbiacapsaintemariensis克氏大戟Euphorbiacremersii(包括型viridifolia和变种rakotozafyi)筒叶大戟(筒叶麒麟)Euphorbiacylindrifolia(包括亚种tuberifera)德氏大戟(皱叶麒麟)Euphorbiadecaryi(包括变种ampanihyensis、robinsonii和spirosticha)费氏大戟(潘郎麒麟)Euphorbiafrancoisii莫氏大戟Euphorbiamoratii(包括变种antsingiensis、bemarahensis和multiflora)小序大戟Euphorbiaparvicyathophora扁枝大戟Euphorbiaquartziticola图拉大戟EuphorbiatulearensisEuphorbiamisera和被列入附录阁Euphorbiatrigona栽培品种的Euphorbianeriifolia人工培植变异的龟纹箭Euphorbia★蒙古栎Quercusmongolica(俄罗斯)簇生福桂花Fouquieriafasciculata普氏福桂花Fouquieriapurpusii玉)Fouquieriacolumnaris★买麻藤Gnetummontanum(尼泊枫桃Oreomunneapterocarpa玫瑰安妮樟Anibarosaeodora巴西黑黄檀Dalbergianigra德米古夷苏木GuibourtiademeuseiGuibourtiapellegriniana特氏古夷苏木Guibourtiatessmannii巴西苏木Paubrasiliaechinata大美木豆Pericopsiselata多穗阔变豆Platymisciumparviflorum刺猬紫檀Pterocarpuserinaceus檀香紫檀Pterocarpussantalinus染料紫檀Pterocarpustinctorius南方决明Sennameridionalis微白芦荟Aloealbida白花芦荟(雪女王)Aloealbiflora阿氏芦荟Aloealfredii贝氏芦荟(斑蛇龙)Aloebakeri美丽芦荟Aloebellatula喜钙芦荟Aloecalcairophila扁芦荟Aloecompressa(包括变种vars.paucituberculata,rugosquamosa和schistophila)德尔斐芦荟Aloedelphinensis德氏芦荟Aloedescoingsii脆芦荟Aloefragilis十二卷状芦荟(琉璃姬孔雀)Aloehaworthioides(包括变种var.aurantiaca)列入附录的翠叶芦荟Aloevera，亦即Aloebarbadensis)海伦芦荟Aloehelenae艳芦荟Aloelaeta(包括变种var.maniaensis)平列叶芦荟Aloeparallelifolia小芦荟Aloeparvula皮氏芦荟(女王锦)Aloepillansii多叶芦荟Aloepolyphylla劳氏芦荟Aloerauhii索赞芦荟Aloesuzannae变色芦荟Aloeversicolor沃氏芦荟Aloevossii★盖裂木Magnolialiliiferavar.obovata(尼泊格氏猴面包树Adansoniagrandidieri矮桃花心木Swieteniahumilis#4大叶桃花心木Swieteniamacrophylla#6(新热带种群)桃花心木Swieteniamahagoni劈裂洋椿Cedrelafissilis(玻阿根廷洋椿Cedrelaodorata(巴西和玻利维亚、以及卡西猪笼草Nepentheskhasiana拉贾猪笼草NepenthesrajahNepenthesspp.★水曲柳Fraxinusmandshurica(俄罗斯)马达加斯加船形兰Aerangisellisii大花蕾立兰Cattleyajongheana浅裂蕾立兰Cattleyalobata血色石斛Dendrobiumcruentum墨西哥兜兰Mexipediumxerophyticum★兜兰属所有种Paphiopedilumspp.鸽兰Peristeriaelata美洲兜兰属所有种Phragmipediumspp.★云南火焰兰Renantheraimschootiana★肉苁蓉Cistanchedeserticola拟散尾葵Dypsisdecipiens马岛葵Beccariophoenixmadagascariensis三角槟榔(三角椰)Dypsisdecaryihalleuxii子)Marojejyadarianii繁序雷文葵Ravenealouvelii子)Ravenearivularis林扇葵Satranaladecussilvae长苞椰Voanioalagerardii巨籽棕Lodoiceamaldivica(塞舌尔)尼泊尔绿绒