生物反应器校准规范

PAGE1PAGEII生物反应器校准规范1范围本规范适用于实验室用的搅拌式生物反应器的性能参数的校准，其他中试用生物反应器、光生物反应器、气升式生物反应器等相关反应器可参照此规范执行。2引用文件本规范引用了下列文件：JJG119实验室pH（酸度）计JJG291溶解氧测定仪JJG1871磁电式转速传感器JJF1030恒温槽技术性能测试规范JJF1265生物计量术语及定义JJF1001通用计量术语及定义JJF1101环境试验设备温度、湿度参数校准规范凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于该规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。3术语和计量单位JJF1001－2011、JJF1265－2010中界定的及以下术语和定义适用于本规范。3.1生物反应器bioreactor生物反应器一般是指用于进行是进行相应条件下微生物的培养、发酵，从而获取活体微生物或其所需的代谢产物的相应生产或实验仪器。3.2灭菌sterilization用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒蛋白，使之达到无菌保障水平。常用的灭菌方法有化学试剂灭菌（如环氧乙烷、甲醛等）、射线灭菌（如γ射线、电子束辐射等）、湿热灭菌、干热灭菌和过滤除菌等。3.3菌落形成单位colony-formingunit，CFU菌落形成单位是指单位体积样品在X脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的细菌群落总数，是计算细菌或霉菌数量的单位。4概述生物反应器一般是指用于进行是进行相应条件下微生物的培养、发酵，从而获取活体微生物或其所需的代谢产物的相应生产或实验仪器。生物反应器类型众多，本规范主要针对实验室使用的搅拌式生物反应器。中试生物反应器或其他类型反应器可参照本规范的相关参数进行校准工作。图1常用生物反应器示意图生物反应器是一种利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统。它主要通过在封闭或半封闭的无菌环境容器中，通过合适的技术手段，针对特定的生物反应过程，对生物反应环境的温度、pH值、转速、溶解氧、气体流速、压力等条件进行监控，并利用监控结果进行反馈调节而控制罐体内环境的稳定，从而达到在充分利用底物的情况下获得较高的目标产物的目的。图1所示为常用的实验室搅拌式生物反应器的基本结构。搅拌式生物反应器主要由反应器罐体、管路组件、监控传感器及配套的控制单元组成。管路组件包括进样管、取样管、进气管、排气管等。监控传感器包括温度传感器、pH传感器、溶解氧传感器以及相应的显示设备。配套控制单元包括进样泵、搅拌电机、恒温装置等。目前，大量生物反应器已经将监控显示和控制单元等都集成在电脑或控制面板上，便于统一进行设定、监控和联动管理。实验室用生物反应器一般以台式为主，罐体方便拆卸。部分实验室也会使用原位生物反应器，这类反应器一般会另外配备原位灭菌系统，便于试验前后的清洗、灭菌工作。5计量特性生物反应器的计量项目及参考计量性能要求检表1。表1生物反应器的计量性能指标序号校准项目参考计量性能要求1温度温度示值误差±1.0℃温度波动度0.5℃2pH*pH示值误差±0.2pHpH重复性0.1pH3转速转速示值误差±3%4溶解氧*溶解氧浓度示值误差±0.5mg/L溶解氧浓度重复性0.15mg/L5气体流量*气体流量示值误差±5%6液体流量*液体流量示值误差±5%液体流量稳定性5%7无菌性能测试*无菌落检出注1：以上技术指标不适用于合格性判定，仅供参考。计量性能指标也可参照反应器制造厂商给出的技术要求。注2：*根据反应器的适用项目，选择进行项目的校准。6校准条件6.1环境条件6.1.1供电电源：（220±22）V，（50±1）Hz。6.1.2环境温度：（10~30）℃。6.1.3相对湿度：≤85％。6.1.4室内应防潮、避光、防热、无腐蚀性物品，通风良好。6.2校准用标准物质及设备6.2.1温度计：温度测量范围（5.0～50.0）℃，最大允许误差±0.2℃，精度不低于0.01℃。6.2.2pH有证标准物质：应使用经政府计量行政部门批准的pH有证标准物质。6.2.3光电转速表：转速测量范围（0~2000）rpm，不确定度不大于3%（k=2）。6.2.4气体流量计：流量测量范围（0.3~30）L/min，不确定度不大于3%（k=2）。6.2.5电子天平：实际分度值不大于0.1mg，eq\o\ac（○，Ⅰ）级。6.2.6气压表：分度值1hPa，最大允许误差不超过±2.5hPa。6.2.7秒表：分辨力0.1s，最大允许误差不超过0.5s/d。6.2.8鼓泡器：多孔。6.2.9亚硫酸钠（Na2SO3）试剂：分析纯。6.2.10二价钴盐试剂：分析纯。7校准项目和校准方法7.1校准前准备及检查检查待校生物反应器铭牌标识是否完好。将待校生物反应器开机预热，并确定生物反应器各传感器工作正常。7.2温度示值误差设置反应器温度在37℃，或根据实际使用情况设定一个或多个恒温温度点。将反应器的温度探头放入反应器内，与标准数字温度计靠近放置于反应器同一水平面。在设定的温度点，同时分别读取生物反应器温度示值TR和标准数字温度计示值TS，分别读取三次，取各自的三次平均值为该温度点的EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R、EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S，按式（1）计算ΔT。ΔT=EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R-EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S（1）式中：EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R——生物反应器的温度探头平均值，℃；EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S——标准数字温度计示值平均值，℃；ΔT——温度示值误差，℃。7.3温度波动度设置反应器温度在37℃，或根据实际使用情况设定一个或多个恒温温度点。将反应器设置开启，使其处于工作状态。将标准数字温度计插入工作区域内1/2深度位置或反应器温度探头位置，在反应器第一次达到设定温度后稳定至少10min或反应器使用说明书要求的稳定时间，开始读数。以每分钟至少6次的均匀间隔读取示值，持续10min或反应器使用说明书中规定的时间。取最大值与最小值的差，换算为温度值，即为反应器在该温度点下相应时间间隔内的波动度。ΔTf=Tmax-Tmin（2）式中：Tmax——测量期间数字温度计最大示值，℃；Tmin——测量期间数字温度计最小示值，℃；ΔTf——温度波动度，℃。7.4pH示值误差及重复性按仪器操作要求，使仪器处于稳定工作状态。对待测反应器的酸度（pH）计传感探头，用一种标准溶液（对具有两点校准或多点校准方法的传感器，应选用两种或多种溶液校准）校准后，测量另一种标准溶液。测量点可根据实际常用点进行选择。进行重复测量操作6次，取平均值作为仪器示值，按式（3）计算该反应器的pH计传感器示值误差值ΔpH。测量时应注意温度平衡及温度修正。ΔpH=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i-pHS（3）式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i——仪器示值平均值，pH；pHS——pH缓冲溶液标准值，pH；ΔpH——pH示值误差，pH。取6次仪器示值结果，按式（4）计算pH重复性结果SpH。SpH式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i——仪器示值平均值，pH；pHi——单次仪器示值，pH；n——测量次数，6次；SpH——pH示值重复性，pH。7.5溶解氧浓度测量示值误差及重复性按操作要求使仪器处于稳定工作状态。用新配制的无氧水（配制方法见附录A）对溶解氧探头进行测试、校准。随后，根据实际校准需求，配制准备好饱和溶氧水（配制方法见附录A），用生物反应器溶解氧传感器测量饱和溶氧水6次，取其平均值与饱和溶氧水的标准值之差作为该生物反应器的溶解氧示值误差。若溶解氧传感器自带温度补偿功能，则需要在温度误差低于±0.2℃情况下进行，否则溶解氧的温度自动补偿不能认可。溶解氧传感器操作可依据生物反应器的说明书执行，对不进行溶解氧监测的反应器可不做此项。ΔC=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)-CS（5）式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)——6次溶解氧测量平均值，mg/L；；CS——溶解氧标准值，mg/L；ΔC——溶解氧示值误差，mg/L。取6次测量数据结果，按照式（6）计算溶解氧重复性SC。SC式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)——6次溶解氧测量平均值，mg/L；Ci——待测溶液溶解氧的测量值，mg/L；n——测量次数，6次；SC——溶解氧测量重复性，mg/L。7.6转速示值误差将反光转速贴片贴于搅拌器旋转叶片或转动轴上，在测量范围内设置3档转速，分别为50r/min、200r/min、500r/min，或根据实际使用情况选择一个或多个转速测量点。用光电转速表对准反光贴片位置测量实际转速，每档转速下测量3次，取平均值x标准，通过式（7）计算转速相对误差。根据得到的不同转速下的转速误差，选取其中绝对值最大的相对误差值作为该生物发酵罐的转速误差。δL式中：δL——转速相对误差，r/min；xi——转速设定值，r/min；x标准——转速测量平均值，r/min。7.7液体流量设定值误差和流量稳定性根据仪器的计量需求，选择需要计量的液体蠕动泵对象（一般为碱泵、酸泵、补料泵、消泡泵等相关泵管）。选择适配的管路连接液体管路出口、入口，以纯水作流动相，通过管路系统，使计量对象管路中充满流动相。将温度计插入流动相，监控试验温度。选择该蠕动泵的流速范围中适当的流量，或根据实际使用需求选择一至三个流速测量点，分别进行测量。开启蠕动泵，当泵运行稳定后，选用事先称重的合适的容量瓶，分别接收规定时间流出的流动相。不同流速下的测量次数、时间建议如下表。将收集好流动相的容量瓶在分析天平上称重，重复三次，按公式（8）计算流量的实测值，分别按公式（9）和公式（10）计算流量设定值误差SS及流量稳定性误差SR。表2泵流速测定参数表泵流速测定参数表（ml/min）0.2~1.01.0~1010~100测量次数333流动相收集时间（min）10~205~105Fm式中：Fm——流量实测值，mL/min；W1——容量瓶的质量，g；W2——容量瓶加流动相的质量，g；ρt——实验温度下流动相的密度（不同温度下流动相的密度参见附录B），g/cm3；t——收集流动相的时间，min。Ss式中：Ss——流量示值误差，%；FmFs——流量设定值，mL/min。SR=式中：SR——流量稳定性，%；Fmax——同一设定流量3次测量值的最大值，mL/min；Fmin——同一设定流量3次测量值的最小值，mL/min；Fm7.8气体流量示值误差选取实际常用的气体介质，将气体流量测量装置串联入气体流路中。调节反应器的气体流量计，选择用户常用范围内一个或多个的气体流量作为测量点，连续测量3次，记录每次的测定值Qi，计算得平均值QδQ式中：QsQiδQ7.9无菌性能测试按操作要求以常规工作流程进行灭菌处理，选择用户常用的反应器准备流程和使用程序，进行培养反应24小时，或选择用户常用的培养时间，观察培养液中是否有菌体生成。同时，通过无菌操作对最终培养液进行取样，选择合适的培养基（一般与反应器使用培养基一致），对原梯度的最终培养液进行平板稀释涂布，平行处理3次。设定适当的培养条件，将平板置于培养箱中进行培养，观察是否有菌落形成。若仪器无菌性能良好，培养结束后，平板上应无菌落检出（小于5CFU/mL）。8校准结果表达8.1校准记录校准记录格式参见附录C。8.2校准结果的处理校准结果应在校准证书上反映，校准证书应至少包括以下信息：a）标题：“校准证书”；b）实验室名称和地址；c）进行校准的地点（如果与实验室的地址不同）；d）证书的唯一性标识（如证书编号），每页及总页数的标识；e）客户的名称和地址；f）被校对象的描述和明确标识（如生产厂家、型号、产品编号等）；g）进行校准的日期，如果与校准结果的有效性和应用相关时，应说明被校对象的接收日期；h）如果与校准结果的有效性应用相关时，应对被校样品的抽样程序进行说明；i）校准所依据的技术规范的标识，包括名称和代号；j）本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明；k）校准环境的描述；l）校准结果及其测量不确定度的说明；m）对校准规范的偏离的说明；n）校准证书或校准报告签发人的签名、职务或等效标识；o）校准结果仅对被校对象有效的声明；p）未经实验室书面批准，不得部分复制证书或报告的声明。推荐的校准原始记录格式、校准证书内页格式分别见附录C、附录D。9复校时间间隔由于复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等诸因素所决定的，因此送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。如果对仪器的检测数据有怀疑或仪器更换主要部件及修理后应对仪器重新校准。生物反应器的复校时间间隔建议不超过12个月。

附录A溶解氧校准用水的制备A.1无氧水的制备500mL的烧杯中加入250mL的蒸馏水，然后加入500mg的亚硫酸钠以及微量二价钴盐（如六水合氯化钴）作为催化剂。搅拌均匀后使用。A.2饱和溶氧水的制备在恒温水浴内灌入2/3容积的新鲜蒸馏水（约8L），将多孔塑料浮盖浮于水面。水温调节到所需温度，开动搅拌器搅拌水样，同时加鼓泡器（空气泵）向水中连续曝气60min以上。停止曝气，水静止30min后即可使用。

附录B国际温标纯水密度表表B.11990年国际温标纯水密度表（kg/m3）t90（℃）0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.915999.099999.084999.069999.053999.038999.022999.006998.991998.975998.95916998.943998.926998.910998.893998.876998.860998.843998.826998.809998.79217998.774998.757998.739998.722998.704998.686998.668998.650998.632998.61318998.595998.576998.557998.539998.520998.501998.482998.463998.443998.42419998.404998.385998.365998.345998.325998.305998.285998.265998.244998.22420998.203998.182998.162998.141998.120998.099998.077998.056998.035998.01321997.991997.970997.948997.926997.904997.882997.859997.837997.815997.79222997.769997.747997.724997.701997.678997.655997.631997.608997.584997.56123997.537997.513997.490997.466997.442997.417997.393997.396997.344997.32024997.295997.270997.246997.221997.195997.170997.145997.120997.094997.06925997.043997.018996.992996.966996.940996.914996.888996.861996.835996.80926996.782996.755996.729996.702996.675996.648996.621996.594996.566996.53927996.511996.484996.456996.428996.401996.373996.344996.316996.288996.26028996.231996.203996.174996.146996.117996.088996.059996.030996.001995.97229995.943995.913995.884995.854995.825995.795995.765995.753995.705995.67530995.645995.615995.584995.554995.523995.493995.462995.431995.401995.37031995.339995.307995.276995.245995.214995.182995.151995.119995.087995.05532995.024994.992994.960994.927994.895994.863994.831994.798994.766994.73333994.700994.667994.635994.602994.569994.535994.502994.469994.436994.40234994.369994.335994.301994.267994.234994.200994.166994.132994.098994.06335994.029993.994993.960993.925993.891993.856993.821993.786993.751993.716

附录C生物反应器校准原始记录格式（推荐）送校单位：仪器名称：规格型号：出厂编号：制造厂家：测量范围：校准依据：校准地点：环境条件：温度℃湿度％RH大气压kPa其它：使用的标准器名称型号规格编号技术特征温度示值误差设定值/℃TR/℃EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R/℃TS/℃EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S/℃ΔT/℃温度波动度温度测量值/℃Tmax/℃Tmin/℃ΔTf/℃pH示值误差及重复性液温pH有证标准物质/pH认定值/pHpH计测量值/pH平均值/pH示值误差/pH重复性/pH℃校准点1CRM编号：批号：校准点2CRM编号：批号：校准点3CRM编号：批号：溶解氧浓度测量示值误差及重复性标准值/（mg/L）测量值/（mg/L）平均值/（mg/L）示值误差/（mg/L）重复性/（mg/L）转速示值误差设定转速/（r/min）实际测量值/（r/min）平均值/（r/min）示值误差/%液体流量设定值误差和流量稳定性FS/（mL/min）W1/gW2/gT/minFmFSSSR气体流量示值误差设定流量/（L/min）实际测量值/（L/min）平均值/（L/min）示值误差/%无菌性能测试培养结束后平板上菌落计数为个。校准员：核验员：校准日期：年月日

附录D生物反应器校准证书内页格式（推荐）证书编号：××××-××××校准结果序号校准项目参考计量性能指标校准结果1温度示值误差±1.0℃2温度波动度0.5℃3pH示值误差±0.2pH4pH重复性0.1pH5转速示值误差±3%6溶解氧浓度示值误差±0.5mg/L7溶解氧浓度重复性0.15mg/L8气体流量示值误差±5%9液体流量示值误差±5%10液体流量稳定性5%11无菌性能测试无菌落检出温度测量结果扩展不确定度：=%，=2；pH示值测量结果扩展不确定度：转速测量结果扩展不确定度：溶解氧测量结果的扩展不确定度：气体流量测量结果的扩展不确定度：液体流量测量结果的扩展不确定度：第×页，共×页

附录E生物反应器校准结果的测量不确定度评定示例生物反应器的测量过程中主要涉及的参数有温度、pH、溶解氧、搅拌转速、气体流量和液体流量，参数都为使用标准器进行直接测量，测量结果受其他环境因素的影响可忽略。因此，主要分析测量过程中对测量结果影响较大的不确定度分量来源，对其进行不确定度的评定。E.1温度测量结果不确定度评定E.1.1测量方法按操作说明设置反应器恒温温度37℃，或根据实际使用情况设定一个或多个恒温温度点。将反应器的温度探头放入反应器内，与标准数字温度计靠近放置于反应器同一水平面。在设定的温度点，同时分别读取生物反应器温度示值三次，取各自的三次平均值计算温度示值相对误差。E.1.2测量模型ΔT=EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R-EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S式中：EQ\*jc0\*hps12\o(\s\up11(__),T)R——生物反应器的温度探头平均值，℃；EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),T)S——标准数字温度计示值平均值，℃；ΔT——温度示值误差，℃。E.1.3不确定度来源依据上述测量模型，其不确定度来源主要包括以下2个方面：（1）反应器温度探头测量过程引入的不确定度uTi（2）标准数字温度计测量过程引入的不确定度uTSE.1.4标准不确定度分量计算本示例中选取一台生物反应器，设定温度为37.0℃，等待仪器稳定后，按确定测量方法重复测量温度结果，连续测量10次，测量结果见表E.1。（1）反应器温度探头测量过程引入的不确定度uTi反应器温度探头测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度和仪器温度示值分辨力引入的不确定度。表E.1温度测量结果（单位：℃）测量次数12345678910仪器温度示值37.037.036.936.936.936.937.037.137.137.0标准温度计示值37.0136.9236.8936.9336.9136.8536.9337.0237.0837.02根据测试数据，则：sTi实际测量过程中取3次重复，反应器温度探头测量重复性引入的标准不确定度uTi1：uTi1仪器温度示值分辨力为0.1℃，区间半宽为0.05℃，按均匀性分布考虑，则其分辨力引入的标准不确定度uTi2：uTi2因仪器温度探头测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较大者uTi1，因此，反应器温度探头测量过程引入的不确定度uTi为：uTi=uTi1=0.05℃（2）标准数字温度计测量过程引入的不确定度uTS标准数字温度计测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度、和仪器温度示值分辨力引入的不确定度。根据重复测试数据结果，则：sTs实际测量过程中取3次重复，标准数字温度计测量重复性引入的标准不确定度uTs1：uTs1数字温度计示值分辨力为0.01℃，区间半宽为0.005℃，按均匀性分布考虑，则其分辨力引入的标准不确定度uTs2：uTs2因数字温度计测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较大者uTs1。数字温度计修正值的扩展不确定度为：U=0.03℃，k=2，则修正值引入的标准不确定度uTs3为：uTs3因此，数字温度计测量过程引入的不确定度uTs为：uTsE.1.5标准不确定度分量一览表标准不确定度分量一览表见表E.2。表E.2温度测量结果标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源标准不确定度值（℃）uTi温度探头测量过程引入0.05uTs标准数字温度计测量过程引入0.06E.1.6合成标准不确定度由于标准不确定度分量之间相互独立，则温度测量的合成标准不确定度uTc为：uTcE.1.7扩展不确定度取k=2，则仪器温度示值误差测量结果的扩展不确定度为：UT=k×uTc=0.2℃E.2pH示值误差测量结果不确定度评定E.2.1测量方法根据仪器操作方法对待测反应器的酸度（pH）计传感探头进行校准。根据实际需求选择合适的pH标准溶液，使用仪器pH探头对pH标准溶液进行测量。重复测量操作6次，取平均值作为仪器示值结果，其与pH标准溶液的标准值之差作为pH示值误差。E.2.2测量模型ΔpH=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i-pHS式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(__),p)EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),H)i——仪器示值平均值，pH；pHS——pH溶液标准值，pH；ΔpH——pH示值误差，pH。E.2.3不确定度来源依据上述测量模型，其不确定度来源主要包括以下2个方面：（1）pH传感器测量过程引入的不确定度upHi（2）pH溶液标准物质引入的不确定度upHSE.2.4标准不确定度分量计算本示例中选取一台生物反应器，仪器稳定后恒温至25℃。将仪器pH传感器校准后，对pH溶液标准物质（本例使用混合磷酸盐标准物质）进行测量，按测量方法重复测量pH结果，连续测量10次，测量结果见表E.3。表E.3pH测量结果（单位：pH）测量次数12345678910仪器示值6.836.826.826.816.826.816.816.816.806.81（1）pH测量过程引入的不确定度upHi反应器pH探头测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度和pH示值分辨力引入的不确定度。根据测试数据，则：spHi实际测量过程中取6次重复，反应器pH探头测量重复性引入的标准不确定度upHi1：upHi1仪器pH示值分辨力为0.01pH，区间半宽为0.005pH，按均匀性分布考虑，则其分辨力引入的标准不确定度upHi2：upHi2因仪器pH探头测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较大者，因此，反应器pH探头测量过程引入的不确定度upHi为：upHi=upHi1=0.004pH（2）pH溶液标准物质引入的不确定度upHSpH溶液标准物质引入的不确定度包括标准物质本身量值的不确定度和温度对pH值影响的不确定度。根据标准物质得知，pH溶液标准物质的扩展不确定度为：U=0.01pH，k=2。则标准物质本身量值引入的标准不确定度为：upHS在不同温度下，pH标准物质的pH是不同的。硼砂为原料的pH标准溶液温度系数最大，其可能引入的不确定度也最高，因而以硼砂为例计算温度对pH溶液标准物质影响的不确定度。硼砂的pH值温度系数为0.009/℃，则：upHS式中：δ1——恒温水槽的均匀性，本例使用恒温水槽均匀性为±0.2℃；δ2——恒温水槽的稳定性，本例使用恒温水槽稳定性为0.2℃；MPE——温度探头测温的最大允许误差，本例中测温最大允许误差为0.5℃。因此，pH溶液标准物质引入的不确定度upHS为：upHSE.2.5标准不确定度分量一览表标准不确定度分量一览表见表E.4。表E.4pH测量结果标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源标准不确定度值（pH）upHipH测量过程引入0.004upHSpH溶液标准物质引入0.006E.2.6合成标准不确定度由于标准不确定度分量之间相互独立，则pH测量的合成标准不确定度upH为：upE.2.7扩展不确定度取k=2，则仪器pH示值误差测量结果的扩展不确定度为：UpH=k×upH=0.02pHE.3溶解氧示值误差测量结果不确定度评定E.3.1测量方法根据仪器操作方法对待测反应器的溶解氧传感探头进行测试、校准。根据实际需求配制好饱和溶解氧水，使用仪器溶解氧探头对饱和溶氧水溶液进行测量。重复测量操作6次，取平均值作为仪器示值结果，其与饱和溶氧水的理论值之差作为溶解氧示值误差。E.3.2测量模型ΔC=EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)-CS式中：EQ\*jc2\*hps12\o\ad(\s\up11(___),C)——6次溶解氧测量平均值，mg/L；；CS——溶解氧标准值，mg/L；ΔC——溶解氧示值误差，mg/L。E.3.3不确定度来源依据上述测量模型，其不确定度来源主要包括以下2个方面：（1）溶解氧测量过程引入的不确定度uCi（2）饱和溶氧水溶液引入的不确定度uCSE.3.4标准不确定度分量计算本示例中选取一台生物反应器，仪器运行至恒温稳定。使用仪器溶解氧探头进行测量，按测量方法重复测量溶解氧结果，连续测量10次，测量结果见表E.5。表E.5溶解氧测量结果（单位：mg/L）测量次数12345678910仪器示值8.238.258.328.318.288.278.318.318.258.26（1）溶解氧测量过程引入的不确定度uCi反应器溶解氧探头测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度和溶解氧示值分辨力引入的不确定度。根据测试数据，则：sCi实际测量过程中取6次重复，反应器pH探头测量重复性引入的标准不确定度uCi1：uCi1仪器溶解氧示值分辨力为0.01mg/L，区间半宽为0.005mg/L，按均匀性分布考虑，则其分辨力引入的标准不确定度uCi2：uCi2因仪器溶解氧探头测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较大者，因此，反应器溶解氧探头测量过程引入的不确定度uCi为：uCi=uCi1=0.013mg/L（2）饱和溶氧水溶液引入的不确定度uCS在不同温度和大气压力下，饱和溶氧水的溶解氧浓度是不同的。饱和溶氧水引入的不确定度来源主要包括饱和溶氧水发生装置的温度、大气压力。根据溶解氧饱和浓度值表和内插法，本示例温度为25.0℃，大气压为100.5kPa，那么该环境下温度变化每升高1℃引起溶解氧变化的最大系数为0.15mg/L/℃，大气压力每升高0.1kPa引起的溶解氧变化的系数为0.085mg/L/kPa。本示例恒温水槽的均匀性为±0.2℃，稳定性为0.2℃，温度测试最大允许误差为0.5℃，空盒气压表的修正扩展不确定度为UP=0.05kPa，k=2。各引入的不确定度变量不相关，则，本示例中饱和溶氧水引入的不确定度uCS为：uCS式中：δ1——恒温水槽的均匀性；δ2——恒温水槽的稳定性；MPE——温度探头测温的最大允许误差0.5℃；UP——气压修正不确定度。E.3.5标准不确定度分量一览表标准不确定度分量一览表见表E.6。表E.6溶解氧测量结果标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源标准不确定度值（mg/L）uCi溶解氧测量过程引入0.013uCS饱和溶氧水溶液0.047E.3.6合成标准不确定度由于标准不确定度分量之间相互独立，则溶解氧测量的合成标准不确定度uC为：uCE.3.7扩展不确定度取k=2，则仪器溶解氧示值误差测量结果的扩展不确定度为：UC=k×uC=0.10mg/LE.4转速示值误差测量结果不确定度评定E.4.1测量方法将反光转速贴片贴于搅拌器旋转叶片或转动轴上，根据实际情况设置合适的转速测量点。用光电转速表对准反光贴片位置测量实际转速，重复测量3次，取平均值x标准，并通过公式计算转速相对误差。E.4.2测量模型δ式中：δL——转速相对误差，r/min；xi——转速设定值，r/min；x标准——转速测量平均值，r/min。E.4.3不确定度来源依据上述测量模型，其不确定度来源主要包括以下3个方面：（1）转速重复测量过程引入的相对不确定度ur1（2）标准器引入的相对不确定度ur2（3）搅拌电机分辨力引入的相对不确定度ur3E.4.4标准不确定度分量计算本示例中选取一台生物反应器，仪器运行至搅拌电机运行转速稳定。使用光电转速表对转速进行测量，按测量方法重复测量转速结果，连续测量10次，测量结果见表E.7。表E.7转速测量结果（单位：r/min）测量次数12345678910实测值120.4120.2120.2120.3119.8119.7120.0120.1120.5120.2（1）转速重复测量过程引入的相对不确定度ur1根据测试数据，则：sri实际测量过程中取3次重复，那么针对该转速下：ur1（2）标准器引入的相对不确定度ur2根据光电转速表的标准器溯源证书，可知其相对扩展不确定度为UrelS=0.01%，k=2。则标准器引入的相对不确定度ur2为：ur（3）搅拌电机分辨力引入的相对不确定度ur3仪器搅拌转速示值分辨力为1r/min，区间半宽为0.5r/min，按均匀性分布考虑，则在该转速下其分辨力引入的相对标准不确定度ur3：ur3E.4.5标准不确定度分量一览表标准不确定度分量一览表见表E.8。表E.8转速测量结果相对标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源相对标准不确定度值（%）ur1转速重复测量过程引入0.12ur2标准器引入0.005ur3搅拌电机分辨力0.24E.4.6合成相对标准不确定度由于相对标准不确定度分量之间相互独立，则转速测量的合成相对标准不确定度urx为：urxE.4.7相对扩展不确定度取k=2，则仪器转速示值误差测量结果的相对扩展不确定度为：Urx=k×urx=0.6%E.5液体流量示值误差不确定度评定E.5.1测量方法根据生物反应器的配置需求，选择相应的蠕动泵及管路。选择适配的管路连接液体管路出口、入口，以纯水作流动相，通过管路系统运行，使其充满流动相。将温度计插入流动相，监控试验温度。根据需要选择该蠕动泵的流速范围中适当的流量，进行测量。开启蠕动泵，运行稳定后，选用事先称重的合适的容量瓶，分别接收规定时间流出的流动相。将收集好流动相的容量瓶在分析天平上称重，重复三次，分别计算流量的实测值和流量设定值误差。E.5.2测量模型S式中：Ss——流量示值误差，%；FmFs——流量设定值，mL/min。其中，流量实测值公式为：Fm=（W2-W1）/（ρt×t）式中：Fm——流量实测值，mL/min；W1——容量瓶的质量，g；W2——容量瓶加流动相的质量，g；ρt——实验温度下流动相的密度，g/cm3；t——收集流动相的时间，min。E.5.3不确定度来源依据上述测量模型，其不确定度来源主要包括以下3个方面：（1）液体流量重复测量引入的相对不确定度urF1（2）流动相引入的相对不确定度urF2（3）计时时间引入的相对不确定度urF3E.5.4标准不确定度分量计算本示例中选取生物反应器上的蠕动泵，设定流速为10ml/min，运行至稳定。按测量方法重复测量流量结果，连续测量10次，测量结果见表E.9。表E.9液体流量测量结果（单位：