生物化学实验

碘价的测定(Hanus)法三、实验原理在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯起加成反应。脂肪分子中如含有不饱和脂酰基，即能吸收碘。100g脂肪所吸收碘的克数称为碘价。碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。由于碘与脂肪的加成作用很慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，使产生溴化碘，再与脂肪作用。将一定量(过量)的溴化碘(Hanus试剂)与脂肪作用后，测定溴化碘剩余量，即可求得脂肪之碘价，本法的反应如下：I2+Br2-->2IBr(Hanus试剂)IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr—KI+CH3COOH-->HI+CH3COOKHI+IBr-->HBr+I2I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6(滴定)四、实验试剂及材料仪器1、Hanus试剂：溶13.20升华碘于1000ml冰醋酸(99.5％)内，溶时可将冰醋酸分次加入，并置水浴中加热助溶，冷后，加适当之溴(约3ml)使卤素值增高一倍。此溶液储于棕色瓶中。2、15％碘化钾溶液称取150g碘化钾溶于水，稀释至1000ml。3、标准硫代硫酸钠溶液(约0.1N)25g纯硫代硫酸钠晶体Na2S2O3．5H20溶（C·P以上规格)于经煮沸后冷却的蒸馏水中，稀释至1000ml，此溶液中可加入少量(约50mg)Na2CO3，数日后标化。标化方法：精密称取在1200C干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15—0.20g2份，分别置于两个500ml碘瓶中，各加水约30ml使溶解，加入固体碘化钾2.0g及6NHCll0ml：混匀，塞好，置暗处3分钟，然后加入水200ml稀释，用Na2S203滴定，当溶液由棕变黄后，加淀粉液3ml，继续滴定至呈淡绿色为止，计算Na2S2O3溶液的准确浓度。滴定的反应：K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2OI2+2S2O2-—>2I-+S4O2-4、1％淀粉液五、实验方法准确称取0.2g脂肪，置于碘瓶(图5中)，加10ml氯仿作溶剂，待脂肪溶解后，加入Hanus试剂20ml，(注意勿使碘液沾在瓶颈部)，塞好碘瓶，轻轻摇动，摇动时亦应避免溶液溅至瓶颈部及塞上，混匀后，置暗处(或用黑布包裹碘瓶)30分钟，于另一碘瓶中置同量试剂，但不加脂肪，作空白试验。60分钟后，先注少量15％碘化钾溶液于碘瓶口边上，将玻塞稍稍打开，使碘化钾溶液流入瓶内，并继续由瓶口边缘加入碘化钾溶液，共加20ml，再加水100ml，混匀，两个样品一起加入，终止反应。随即用标准硫代硫酸钠溶液滴定。初加硫代硫酸钠溶液时可较快，俟瓶内液体呈淡黄色时。加淀粉液1ml，继续滴定，滴定将近终点时(蓝色已淡)，可加塞振荡，使与溶于氯仿中之碘完全作用，继续滴定至蓝色恰恰消失为止，记录所用硫代硫酸钠溶液量，用同法滴定空白管。按下式计算碘价：碘价=式中B：滴定空白所耗Na2S2O3溶液毫升数；S：滴定样品所耗Na2S2O3溶液毫升N：Na2S2O3溶液的当量浓度。七、实验注意事项1、油脂加入Hanus试剂后，要将碘瓶的塞子塞好，防止碘挥发，同时在塞子的周围滴上几滴KI，以便将塞子密封，碘瓶一定要放在暗处。2、在向碘瓶中加KI和水时，一定要先加在塞子的周围，然后打开塞子，使其进入碘瓶中。3、在进行Na2S2O3滴定时，开始不要加淀粉指示剂，当滴定到颜色变为浅黄色是再加淀粉，当滴定快到终点时，要用力摇碘瓶中的溶液，以便溶解在氯肪中的碘重新溶解在溶液中，否则滴定结果不够准确。4、本实验需要做样品的两个平行实验，一个空白实验。五、思考题1.测定碘值有何意义？在一定条件下，每100g脂肪所吸收的碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。2.加入IBr后，为何要在暗处放置？在进行碘值测定过程中需要将其放在暗处，目的是为了防止IBr见光分解。3.滴定过程中，为何淀粉溶液不能过早加入？淀粉的螺旋腔可以结合碘，从而使滴定结果变的不准确。酪蛋白的制备二、原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、材料、试剂与器具（一）材料：新鲜牛奶（一）试剂1、95%乙醇1200mL2、无水乙醚1200mL3、0.2mol/LpH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液100ml先配A液与B液A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。4、乙醇——乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（V/V）（二）器具1、离心机2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计四、操作步骤（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r/min），弃去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。（三）准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g/100mL牛乳（g%）获得率=制备含量/理论含量

式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。五、注意事项1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。七、思考题1、操作方法中的第二步能否用大量水洗涤？为什么？2、用乙醇、乙醇——乙醚混合液及乙醚洗涤的目的是什么？能否颠倒？答：不能，经过这个次序以后，结晶吸附的溶剂改为乙醚，乙醚沸点低，容易挥散干净，得到纯的洁净，乙醇和乙醚的溶解性能差很远，乙醇实际上介于水和有机溶剂之间，而乙醚是完全的有机溶剂，他们各自去洗涤各自能溶解的物质，从无机（水）到有机（乙醚），最后用乙醚是因为它会很快挥发掉，不留痕迹，可得到纯粹的蛋白质。用正交法测定几种因素对酶活力的影响一．实验原理酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度。这种多因素的试验可通过正交法即用一特制的表格——正交表来安排试验，计算和分析试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法，目前已广泛用于工、农、医药业生产和科学实验中。本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度pH值达四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和PH值时酶的活性最大。通过本实验初步掌握正交法的使用。二．试剂1．2％血红蛋白液：于20ml蒸馏水中加入血红蛋白2.2g；尿素36g，lmol/LNaOH溶液8ml，室温放1小时，使蛋白变性。如有不溶物，可过滤除去。再加0.2mol/LNaH2PO4溶液至110ml及尿素4g，调节溶液PH达7.6左右。2．15％三氯醋酸溶液：15g三氯醋酸溶于蒸馏水，并稀释至100ml。3．牛胰蛋白水解酶液：3mg牛胰蛋白水解酶冷冻干粉，溶于10ml蒸馏水。4．0.lmol/LpH7、8、9巴比妥缓冲液5．Folin-酚试剂：基础实验中Folin-酚试剂法测定蛋白浓度实验三．操作步骤1．实验设计：本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH值。每个因素选三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的“点”）。因素水平（S）（E）温度pH10.2ml0.2ml37720.5ml0.5ml50830.8ml0.8ml609按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑；共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。选用L9表（L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次数）。L9表有两个特性（1）每一列中“1”“2”“3”这三个数字都出现三次，即它门出现的次数是相同的。（2）每两列的横行组成的“数对”共有九个，九种不同的数对（1，1），（1，2），（1，3），（2，1），（2，2），（2，3），（3，1），（3，2），（3，3）各出现一次。在每一列中各个不同的数字出现的次数相同；每两列的横行组成的各种不同的“数对”出现的次数也都相同，这两点就是正交表的特点，它保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此，分析数据比较方便，结果比较可靠。2、试验安排：列号试验号1234111112122231333421235223162312731328321393321表中试验号共九个，表示要做九次试验，每次试验的条件如每一横行所示。如做第一试验时（S）是0.2ml,(E)是0.2ml，温度37℃，pH为7。第二个试验（S）是0.2ml,(E)是0.5ml.温度50具体试验条件如表3-2所示试管号试剂（ml）1582493572%血红蛋白液缓冲液PH72.6PH81.7PH91.7PH82.3PH92.3PH71.4PH92.0PH72.0PH82.037℃50℃60℃酶度37℃50℃60℃各管均加入15%三氯醋酸溶液2ml终止反应。另取试管一支作非酶对照，即加2％血红蛋白液0.5ml，缓冲液2.0ml，先加15％TCA2ml摇匀放置10分钟后再加入酶液0.5ml。将上述酶促和非酶对照各管反应液，室温放置15分钟，过滤，滤液留待Folin-酚法测定酶活力Folin-酚法测定酶活力：取滤液0.5ml，加入试剂A4ml，室温放置10分钟，再加试剂B0.5ml，30分钟后于680nrn测光吸收。3、数据记录及分析：实验做好后，把9个数据填入分析表的试验结果栏内，按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水下试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最后计算极差。极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出那个因素对酶活力影响最大，那个影响最小。找出在何种条件下酶活力最高。最后作一直观分析的结论以A值（I/3，II/3，III/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图。列号试管号1（S）（ml）2（E）（ml）3温度（℃）4PH值试验结果OD680110.210.213717210.220.525028310.230.836039420.510.225039520.520.536017620.530.813728730.810.236028830.820.513739930.830.825017Ⅰ（一水平试验结果总和）Ⅱ（二水平试验结果总和）Ⅲ（三水平试验结果总和）Ⅰ/3，Ⅱ/3，Ⅲ/3极差四．思考题1.正交试验的优点有哪些？①实用上按表格安排试验，使用方便；②布点均衡、试验次数较少；③特别在只有一两个因素起主要作用时，正交试验法能保证主要因素的各种可能都不会漏掉。④正交试验法提供一种分析结果（包括交互作用）的方法，结果直观易分析。且每个试验水平都重复相同次数，可以消除部分试验误差的干扰；⑤因其具有正交性，易于分析出各因素的主效应。2.配置试剂时为什么使蛋白质变型？蛋白质含量的定量测定——双缩脲法具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。试剂1.双缩脲试剂：取1.5g硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500mL蒸馏水中，在搅拌下加入300mL10%NaOH溶液，用水稀释至1000mL。此试剂可长期保存、备用。2.标准和待测蛋白质溶液10mg/mL结晶牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。3.待测蛋白质溶液人血清（稀释10倍）。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。器材试管1.5×