DB51T 2521-2018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程

1DB51DB51/T2521—2018蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程2018-07-23发布2018-08-01实施四川省质量技术监督局发布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 91是指由脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)感染引起的蛙类发病或死亡的2按GB/T4789.28、GB/T18652与SC/T7014规定执行。Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录Infusion,BHIA.1）。28℃培养36h～48h后3将待检菌穿刺接种在精氨酸双水解酶培养基（A.2）上。28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红将待检菌接种于DNA酶培养基平板（A.4）上，28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红色晕圈为阳按SC/T7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）试验的规定执行。培养基下层出现红色为阳性，不出现红9.2.11糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）4取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体；菌体悬浮于500μLTE缓冲液（pH8.06），震荡悬浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.7），10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.8），混匀，37℃温育1h；加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.9），充分混匀，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.10）混匀，65℃温育20min；加入等体积的酚﹕氯仿﹕异戊醇（25:24:1）（A.11），混匀，12000r/min离心5min；取上清液加入等体积的氯仿﹕异戊醇（24:1A.12混匀，12000r/min离心5min；取PCR扩增体系：在PCR管中加入10×PCR缓冲液（无Mg2+）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）1.0μL，引物(20μmol/L)F和R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，无PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min；共35个循环；最用TAE电泳缓冲液（A.13）配制1％的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液（A.14）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20min，当溴酚蓝到达9.3.4.1.4取上清液加入等体5++-+--+-++-+测定的16SrRNA基因DNA序列与附录B6试剂配方 70.1g除DNA和甲苯胺蓝之外的成分，加热熔化后调pH至7.2.加入DNA和甲苯胺蓝将0.121gTris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水将29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL双蒸水中，缓将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE8在400mL双蒸水中溶解121gTris碱，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加双蒸水定容至将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴91ccggggggcgggggtgctata61ctgatgagttgcgaacgggtgagt121tattggaaacgatagctaata241ctcaccaaggcgaaccgataacatagcccgacc301ctgagacacggcycagactc361aagtctgaycgagcawcgccgcgtgagtgamgaasgttttcgg421ttagagaagaacgttggtaggagtggaaaatctacca481ggacggctaactacgtgccagcag541ttattgggcgtaaagcgagc601aaccattgtacgctttggaaactggaggacttg661tgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggagga721gtctgtaactgacgctgaggctcga781agtccacgccgtaaacgatgagtgctaggt841gctaacgcattaagcactccgcctg901tgacgggggcccgcacaagcgg961ttaccaggtcttgacatccttct1021gtgac