生物化学 核酸VIP

第三章核酸化学第一节核酸的组成核酸按含糖的不同分为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）核酸的种类与分布DNA（脱氧核糖核酸）功能：储存遗传信息分布：真核细胞：细胞核内（占98%）；原核细胞：细胞质中的核区RNA（核糖核酸）功能：参与遗传信息的表达分布：主要存在于细胞质mRNA（作为模版指导蛋白质合成）：3-5%；分类tRNA（转运氨基酸）：10-15%；rRNA（核糖体组成成分）：75-80%【注意】：遗传信息储存在核苷酸排序或碱基的排序中；真核细胞中的DNA占细胞DNA总量的98%以上。核苷酸是核酸的结构单元DNA组分：脱氧核糖核苷酸RNA组分：核糖核苷酸核糖DNA中：D-2-脱氧核糖；RNA中：D-核糖【注意】：戊糖均属于D-型糖；核酸中的核糖均为β型核糖碱基【注意】：DNA和RNA都含有胞嘧啶（C），尿嘧啶（U）只存在于RNA中，胸腺嘧啶（T）主要存在于DNA中核苷概念：嘌呤或嘧啶碱基与核糖或脱氧核糖以糖苷键相连称为核苷。特征：碱基均连接在戊糖的1’位碳的半缩醛上嘌呤碱基以第九位氮，嘧啶碱基以第1’位氮连接碱基与糖平面呈垂直关系通常核酸中的核苷基本上呈反式构象，个别片段上有顺式构象存在核糖核苷的缩写以及结构式：稀有核苷【注意】：假尿苷中碱基与核糖之间形成的是C-C键而不是N-C键核苷酸概念：由核苷和磷酸生成的磷酸酯核酸中常见的各种核苷酸、核苷和碱基的缩写:RNADNA碱基核苷核苷酸碱基脱氧核苷脱氧核苷酸AAAMPADPATPAdAdAMPdADPdATPGGGMPGDPGTPGdGdGMPdGDPdGTPCCCMPCDPCTPCdCdCMPdCDPdCTPUUUMPUDPUTPTdTdTMPdTDPdTTP核苷酸可形成核苷二、三磷酸核苷一磷酸：NMP核苷二磷酸：NDP核苷三磷酸：NTPdNTP和ddNTP【注意】：核苷酸可以环化成环化核苷酸：如cAMP和cGMP（第二信使）3’，5’-环化腺苷酸：核苷酸的衍生物能量分子：ATP，GTP酶的辅因子：NAD+，NADP+，FAD等信息交流：GTP调节作用cAMP、cGMP第二节DNA的分子结构DNA分子具有特定的碱基组成Chargaff定则：当量定律：所有生物细胞的DNA中，A=T，G=C不对称比率：不同生物RNA碱基组成不同同种生物不同组织的DNA碱基组成相同DNA的一级结构概念：四种脱氧核糖核苷酸按一定的顺序通过3’，5’-磷酸二酯键连接起来的直线型或环形多聚体。【注意】：1.多核苷酸链具有方向性：5’→3’2.每条多核苷酸链都是独一无二的。（决定因素：核苷酸排列顺序或碱基排列顺序）DNA一级结构表示方法：线条式表示法（了解）字母式表示法：pA-T-C-G-OH（短线式表示法）pApTpCpGpACGTA（缩写式）【注意】一般可在5’端标出“p”表示5’-磷酸基团，3’端标出“-OH”表示3’-OH如果首端不加p，如ACGTA，则默认DNA的5’是左端，3’是右端，核苷酸链方向是从5’→3’。DNA的双螺旋DNA双螺旋的结构两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴向右盘绕形成右手双螺旋。由磷酸和脱氧核糖交替排列形成的主链在双螺旋的外侧,而嘌呤和嘧啶碱基位于双螺旋的内侧。碱基平面与中心轴垂直,核糖平面与中心轴平行双螺旋平均直径2nm,螺距3.4nm,沿中心轴每旋转一周包含10个碱基对,相邻碱基距离为0.34nm,之间旋转的角度为36°。(B-DNA)两条多核苷酸链碱基之间,按A-T,G-C配对原则进行配对（A-T之间形成2个氢键，G-C之间3个氢键）;两条链依靠碱基之间形成的氢键和碱基堆积力结合在一起。螺旋结构上有两条螺旋形凹槽,一条较宽深,称大沟(宽1.2nm、深0.85nm);一条较浅小，称小沟（宽0.6nm、深0.75nm）。DNA双螺旋结构理论的深刻意义：确立了核酸作为信息分子的结构基础，提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式，从而最终确定了核酸是遗传的物质基础。提出了作为遗传功能分子的DNA复制方式，半保留复制是生物体遗传信息的最基本方式。稳定双螺旋结构的因素：氢键、碱基堆积力、离子键。其中碱基堆积力是最主要的稳定因素。DNA双螺旋结构的多态性概念：在溶液中，DNA一般以B-DNA形式存在，但当水合的B-DNA脱水后或溶液中加入乙醇、盐使水的活度降低时，DNA以A-DNA形式存在，除A-DNA、BDNA外，人们还观察到结构参数有一定差异的其它双螺旋DNA，这种现象被称为DNA双螺旋结构的多态性。【注意】：A-DNA、B-DNA均为右手螺旋，Z-DNA为左手螺旋生物体内天然状态的DNA绝大部分以B型构象存在DNA分子超螺旋结构概念：DNA分子在二级结构的基础上进一步扭曲折叠所形成的特定构象连接数（L）：指环形DNA分子一条链缠绕另一条链的次数超螺旋结构的生物学意义：超螺旋能使DNA形成高度致密的状态从而得以容纳于有限的空间中超螺旋的形成可以改变双螺旋结构的解开程度，影响DNA分子与其他分子的相互作用，从而更好地执行其功能三链四链DNA（了解·略）DNA的序列测定方法：酶法（Sanger法/双脱氧法）试剂：DNA单链作为合成互补连的模板4种脱氧核苷酸三磷酸dNTP作为合成DNA的底物与模板单链3’端互补的一小段寡聚核苷酸链作为引物反应的原理：DNA聚合酶按照模板链中的核苷酸顺序，向引物的3’-OH添加dNTP，反应形成了磷酸二酯键，使DNA链延长。Sanger向反应体系中引入了2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP中没有3’-OH，因此当ddNTP掺入到正在合成的DNA链中时，链的延伸即被终止。第三节RNA的分子结构RNA是以3’，5’-磷酸二酯键连接形成的多核苷酸链，大多数RNA为单链线性分子，但通过RNA单链回折可在具有碱基互补配对区域形成局部双螺旋结构。RNA中的双螺旋区通常称为茎区，中间不形成碱基配对的单链区形成突环。这种茎环结构或称发夹结构就是RNA的二级结构。RNA形成的双螺旋结构类似于A型DNA结构。稳定RNA双螺旋区域的最主要因素仍然是碱基堆积力，其次是氢键。RNA据功能分类有：tRNA、mRNA、rRNAtRNA的结构：生理功能：转运氨基酸（最主要），调节蛋白质生物合成的起始，作用于DNA的反转录等等。结构特点：一级结构：分子量在25kD左右，由73-94个核苷酸残基组成，沉降系数约4S碱基组成中有较多的稀有碱基3’-末端都为CCAOH-3’，用来接受活化的氨基酸5’-末端大多为pG。也有为pC二级结构（tRNA的二级结构大多呈三叶草形）•氨基酸臂•二氢尿嘧啶环•反密码环•额外环•TψC环三级结构（倒L形）：L形的一端为氨基酸臂，另一端为反密码环。mRNA的结构概念顺反子（基因）：一个编码区加上合成蛋白质所需的调节序列，就是一个顺反子。单顺反子：一个mRNA分子可以编码一条多肽链，这种mRNA分子被称为单顺反子多顺反子：绝大多数的细菌mRNA分子可以编码两条或多条不同的多肽链，这种mRNA分子叫做多顺反子。翻译区与非翻译区：所有的mRNA都具有翻译区和非翻译区这两种序列编码区（翻译区）：与蛋白质的氨基酸序列对应的用于指导合成蛋白质的序列非翻译区（UTR）：编码区两侧序列，有3’-UTR和5’-UTR【注意】：真核生物mRNA在5’端形成帽子结构，在3’端形成多聚腺苷酸尾的结构真核生物mRNA的5’帽子结构的缩写：m7G5´ppp5´-Np（O型帽子）；m7GpppNmp（Ⅰ型帽子）、m7GpppNmpNmp（Ⅱ型帽子）（“m”代表甲基化，“N”代表任意一种核苷）3’尾端的缩写：3´-polyA对比真核生物和原核生物mRNA的异同原核生物真核生物顺反子多顺反子单顺反子帽子结构与polyA尾无有内含子与外显子无有rRNA的结构真核生物和原核生物的核糖体都由大小两个亚基组成。亚基rRNA种类蛋白质种类核糖体原核生物大亚基50S23S5S31种70S小亚基30S16S21种真核生物大亚基60S28S5.8S5S50种80S小亚基40S18S33种第四节核酸的理化性质及分离提取核酸的理化性质溶解性DNA与RNA微溶于水，但在钠的水溶液中溶解度较大；不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，因此通常采用乙醇沉淀DNA。核酸的水解酸水解（对酸稳定性）：糖苷键对稀酸：RNA表现稳定，DNA中嘌呤形成的糖苷键易被酸水解，嘧啶形成的糖苷键不水解。磷酸二酯键对稀酸：不稳定，易水解。碱水解（对碱稳定性）：DNA中的磷酸二酯键对碱不敏感；RNA中的磷酸二酯键易被稀碱水解，水解成2’-核酸苷和3’-核酸苷酶水解（略）沉降特性蔗糖密度梯度超速离心——制备RNA的常用方法氯化铯密度梯度离心——分离DNA常用的方法粘度DNA溶液的粘度非常高，而RNA溶液的粘度要比DNA溶液小得多。DNA变性或降解时，溶液粘度均降低。紫外吸收组成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱由于具有共轭双键而具有特定的紫外吸收特性，使核酸溶液在260nm附近有最大吸收峰。利用核酸的紫外吸收可以确定核酸的纯度和含量：当提纯双链DNA样品时的OD260/OD280=1.8时，说明纯度很高。当提纯RNA样品时的OD260/OD280=2.0，说明纯度很高。核酸的变性与复性核酸的变性受到某些物理和化学因素的作用，DNA的双螺旋结构破坏，氢键断裂，碱基有规律的堆积被破坏，双螺旋松散，双链分离成两条缠绕的无定形的多核苷酸单链的过程称为变性（DNA的变性导致双螺旋结构的改变，不涉及磷酸二酯键的断裂）变性过程：DNA的紫外吸收值增加；粘度下降；沉降系数和浮力密度增大；比旋光值降低等等增色效应：DNA变性时，双链解开变成单链，使碱基充分的暴露，使其紫外吸收明显增加的现象称为增色效应。减色效应：当变性DNA重新形成双螺旋结构时，碱基又处于双螺旋的内部，此时DNA溶液的紫外吸收降低的现象称为减色效应。熔解温度：通常将增色效应达到一半时的温度或DNA分子有一半发生变性时的温度称为该DNA的熔解温度（Tm）或熔点。与DNA的Tm值有关的因素有：DNA的均一性：均一性越高的DNA样品，发生溶解时的温度范围越窄DNA的（G+C）的含量：（G+C）的含量越高的DNA，Tm值越大，在一定条件下，DNA的Tm值与（G+C）含量之间有正比关系。介质中的离子强度：在离子强度较低的溶液中，DNA的Tm值较低，变性温度也较宽。核酸的复性“复性”概念：变性DNA在适当条件下，两条分开的互补单链重新形成双螺旋结构的过程称为复性。“退火”概念：将变性DNA溶液缓慢冷却，两条分开的单链可以发生互补序列的重新配对，复性为天然状态的DNA，这种缓慢冷却的过程为退火。核酸的分子杂交概念：两条来源不同但有互补关系的DNA单链,或DNA单链与RNA分子,在去掉变性条件后互补的区段能够退火形成双链DNA分子或DNA/RNA异质双链的过程称分子杂交。核酸的分离提取（了解）第五节基因组【注意】基因是生命系统中最基本的信息单位，是一段DNA（有时是RNA），携带者合成活性产物的信息。基因组是细胞或生物体的全部遗传物质。病毒基因组（了解·略）原核生物基因组大肠杆菌的染色体基因组为环状双链DNA分子，大约有4000多个基因，基因的序列是连续的，没有内含子。质粒是染色体能够进行自我复制的遗传单位。真核生物基因组绝大多数真核生物的基因都是不连续的，其中外显子和内含子交替排列，称为割裂基因（或称不连续基因）真核生物基因组是单倍体细胞中维持正常功能的最基本的一套染色体，包括全部的基因以及非编码的序列。真核生物基因组包括了核基因组和细胞基因组。真核生物中，DNA与组蛋白结合形成的核小体是所有染色质中的重复结构单位。核小体结构的主要特点：每个核小体包含约200bp的DNA和5种组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4组蛋白是分子量较小的碱性蛋白质，富含碱性氨基酸Lys，Ar。在生理条件下，组蛋白带正电荷，与带负电荷的DNA结合，有利于DNA的稳定。核小体中，组蛋白内部核心由四种组蛋白H2A、H2B、H3、H4构成致密的八聚体。DNA链在八聚体外部缠