ADME／T工程细胞株的构建调研报告

11.1药物ADME/T性质研究的内容 1 1 5 6 6 6 7 8 9 92.2.1MDCK细胞模型的基本特点 9 2.2.3MDCK单层细胞模型的评价 2.2.4MDCK细胞模型在药物研究中的应用 2.3LLC-PK1细胞模型的基本特点及 3.2药物转运体与药物相互作用研究的指导原则 4.3.1MDCK-MDR1细胞株的构建 株构建及评价 4.6Bcap37-MDR1细胞模型的构建及其评价 4.7多种转运体蛋白共表达的转基因细胞模型 5项目展望(个人看法) 图1药物在体内的转运过程 1图2一个新药从研究开发到成功上市的基本过程 2图3药物研发历程中导致失败的原因分析 3图4ADME模型在药物研发过程中角色的转变 3 5图6Caco-2细胞单层模型 7 图8SCI收录的关于转运体在药动学/药物相互作用方面的文章数量年年递增16图9机体主要器官药物转运体的功能及分布 图10药物转运体细胞模型构建的一般策略 图11LLC-PK1-BCRP单克隆细胞的活性鉴定——Hoechst33342染色法 表1MDCK细胞与Caco-2细胞的比较 表2ABC转运体家族 表4药物相互作用研究相关的转运体 1药物ADME/T研究的概述药物代谢动力学(Pharmacokinetics)是研究药物的体内过程及体内血浆等组织药物浓度随时间变化规律的一门学科(图1所示)。ADME/T是近几年发展起来的、全新的、在细胞水平上早期进行药物的活性与吸收(Absorption)、分布 制药公司年收入的20%用在新药的研发上，全球每年在新药上的投资超过300亿美金(图2所示)。Millionsofscreensforsolubility,stabi在先导化合物的筛选过程中，40%到60%的先导性质检测中被淘汰。导致失败率较高的原因主要有：商业性占5%;动物实验毒性(Tox.)过大占11%;药效不够占30%;人体副作用过大占10%;药物的ADME性质不佳学占39%(图3所示)。全球72%的药物研发费用被浪费在日益增长纵观药物发现的漫长历史，药物研究已经经历了由盲目随机的到有的放矢的、有传统经验性的向现代的科学性的研究方法的转变。90年代药物研究策略主要采用以生物活性为主导的筛选模式，药物研究遵循“分子库——活性筛选——传统QSAR模型——ADME/PK研究——毒性研究——候程(按部就班的“循环式”):而如今的药物研究则遵循“分子库平行筛选 候选药物”的平行过程(齐头并进的“平行式”)。目前，国外制药公司不仅在测定药效的同时平行评价化合物的ADME/T性质，并且建立了体外高通量筛选ADME/T技术(图4所示)。药物早期ADME/T性质研究主要以人源性或人源化组织功能性蛋白质为“药靶”,体外研究技术与计算机模拟等方法相结合，研究药物与体内生物物理和生物化学屏障因素间的相互作用。药物早期ADME/T显示，随着新策略和新技术的应用，因ADME/T问题而终止新药开发的比例下下降为11%。床成功与否的关键(图5所示)。目前世界公认的新药研发三大平台包括药效学(组合化学)的发展，当代药物探索(Drugdiscovery)研究要求采用高通量实图5ADME/T模型在药物研发中的价值贡献批准105传统的药物动力学研究模式已经不能适应现代药物研究的要求，体外高通量ADME/T结合计算机方法称为当今药物研究发展的趋势。ADME/T构成了当代药物化学研究十分重要的方面，并逐渐成为当代药物发现策略的一部分。诚如Selick教授所言：“药物的ADME/T性质将是今后药物设计的首要原则中不可或缺的组成部分”。目前，一个新药进入市场并不是十分有效的过程，其中90%以上已经进入临床研究的药物最终由于药代动力学和药效学因素(如生物利用度差、异常毒性、安全性评价不当以及药物相互作用等)而功亏一篑。导致新药发现如此低的成功率的一个重要原因与药物发现和开发阶段的动物实验数据相关。由于在生理和致病过程中存在着种属间差异性，因此，在药物开发过程中使用的实验动物往往是不可靠的，会给我们提供大量错误的信息。对于这样的情况，人们已开发出基于人体细胞和组织的体外筛选法包括高通量筛选(HTS)和ADME/T进行药物代谢研究，这对预测临床前药物的ADME/T性质和安全性是十分重要的。ADME/T细胞培养模型能在一定程度上模拟体内条件而被广泛用在多种给药系统中进行药物吸收机制及转运途径等方面的研究，尤其是对蛋白质、多肽经过20多年的发展，目前已有很多基于组织水平和细胞水平的ADME/T体外模型用于药物高通量的研究，比较成熟的有用于药物吸收研究的Caco-2细胞浆蛋白结合模型和透血脑屏障模型等。2.1Caco-2细胞模型大量、快速筛选药物的方法之一。其中，Caco-2细胞系来源于人类结肠腺癌，Caco-2细胞单层转运模型是ADME/T的典型方法之一，也是被美国FDA批准的Caco-2细胞在普通培养条件下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自发的分化为肠上皮细胞单层，因此可以模拟体内小肠上皮细胞层。Caco-2细胞具有与小肠绒毛水解酶和各种营养物质转运载体。研究表明I相代谢酶CYP1A1及Ⅱ相代谢酶谷胱甘肽S-转移酶、B-葡糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶在Caco-2细胞中也存在，并保持P-糖蛋白高表达的特征。由于其形态学及生化性质都与小肠上皮很Caco-2细胞培养于T75培养瓶中，培养液为DMEM,其中含胎牛血清、非必需氨基酸及青-链霉素双抗，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养待用。当Caco-2细胞传至20-30代时，将细胞接种在Transwell板的滤膜上，细胞接种密度为(basolateralside,BL)分别加入培养液。将细胞置于37℃,含5%CO₂的培养箱(图6所示)。2.1.3Caco-2单层细胞模型的评价AP侧；(3)跨膜电阻(transepitheliumelectricalresistance,TEER)的测定，以确2.1.4Caco-2细胞模型在口服药物吸收及机制研究方面的应用在着P-gp、MRP外排系统及细胞色素P45腔侧)的转运率，从而对主动转运的药物进行研究；各种转运系统及代谢酶在某些特别的酶(细胞色素P450的一些同工酶)的活性与人体小肠上皮细胞的差马丁达比狗肾细胞系(Madin-DarbyCanineKidney,MDCK)是Madins.H.和2.2.1MDCK细胞模型的基本特点早在1998年Rothen-RutishauserB等就发现MDCK细胞在半透膜上培养，来自同一志愿者十二指肠、空肠、回肠等细胞匀浆中P-gp的表达量，发现表1MDCK细胞与Caco-2细胞的比较项目来源人结肠腺癌狗肾上皮细胞培养周期主要转运体肽类，核苷酸和一元羧酸一元羧酸，二肽，P-gp和阳离子肽类等优点来源于人，表达部分转运蛋白和酶培养周期短，TEER值与人体小肠相近，试验结果重现性较好缺点缺少黏液层，紧密连接过紧，表达的酶与小肠有差异；培养周期长表达转运蛋白水平低，代谢活性低，来源于动物主要应用主动转运，被动转运被动转运MDCK细胞培养于T75培养瓶中，培养液为含10%FBS的MEM,在37℃、5%CO₂的培养箱中培养待用。约3-5d细胞融合达90%后传代，用37℃预热的消化液(0.25%胰酶&0.02%EDTA)室温下消化，传代细胞密度1.5×10⁵个/为了确定MDCK单层细胞的完整性，可以澄清度);(2)细胞生长曲线的绘制。观察MDCK细胞的生长状态，细胞计数法(3)细胞单层TEER的测定；(4)通透性的测定，通常采用荧光素钠、甘露醇、MDCK细胞系自20世纪50年代建立开始，经过几十年的探索，已被大多(1)肠道吸收模型。基于MDCK细胞模型的特性和优势，该细胞模型作为从而实现对基因表达产物在药物吸收中所起作用的研究。HeL等利用MDCK-MDR1细胞模型研究防己诺林碱对紫杉醇双向转运的调节作用，发现防己诺林碱能明显减少紫杉醇的外排，并抑制P-gp介导的抗药耐药相关蛋白1(multidrugresistanee-associatedprotein转运蛋白基因后，发现依托泊试的分泌转运机制涉及P-gp和MRP2转运蛋白，但与MRP1转运蛋白无关。PabfaDimPle等用MDCK细胞模型研究直链脂肪酸对左甲状腺素钠(Levothyroxinesodium,T4)跨上皮转运的影响，发现在T4合成过程中加入低浓度的直链脂肪酸能明显提高T4的通透率，且不存在任何可能导致生物利用度提高的毒(2)肾脏排泄模型。体外培养的MDCK细胞之间能形成TJ、粘附连接、桥等用MDCK-MDR1模型研究了西米替丁与依曲康唑、Psc-833之间的相互作用，证实了P-gp在肾小管有机阳离子分泌中的作用。MDCK细胞转运蛋白1亚型(UT-A1)基因转染至MDCK细胞后，发现新构成的极化细胞模型MDCK-UT-A1稳定能表达UT-A1转运蛋多大鼠内髓集合管上发生的生理反应。MDCK细胞来源于正常的肾组研发提供毒性预测信息。YehJH等用MDCK细胞研究了氯化汞的肾毒性及其机制，研究表明MDCK细胞对典型的肾毒物氯化汞特别选模型方法建立符合现代医学规范的用药方式是可以先行一步的。此外，因此是从天然产物(如中药)中寻找具有发展前景先导化合物工作的重要方面。图7简示了基于中药的ADME/T性质研究，为开发始创性候选中药及中药复方肠内细菌转化小肠吸收转化体内分布肝脏代谢/解毒/毒性胆汁排除Caco-2细胞模型药物-血浆蛋白结合模型体外血脑屏障模型原代谢肝细胞/肝微粒体模型究热潮(图8所示)。从药物研发和临床的观点上看，药物转运体的重要性在于其与药物有效性和安全性密切相关。因为它不仅直接干预药物的药代动力学 0资料来源：Pubmed(统计到2014年1月)而影响药物的治疗效果(如图9所示)。给给相关蛋白(Multidrugresistancerelatedprotein,MRP)和乳腺癌耐药蛋白(Breastcancerresistanceprotein,BCRP)等(如表2统计),他们发挥作用均要消耗ATP,等，分子量多为50-100kDa(如表3统计)。全称多药耐药基因/P-糖蛋白AU胆盐分泌蛋白AH多药耐药基因/P-糖蛋白AH乳腺癌耐药蛋白A多药耐药相关蛋白1U多药耐药相关蛋白2A多药耐药相关蛋白3多药耐药相关蛋白4AK多药耐药相关蛋白5U多药耐药相关蛋白6U表3SLC转运体家族全称牛胆磺酸协转运多肽有机阴离子转运多肽1A2有机阴离子转运多肽1B1H有机阴离子转运多肽1B32H有机阳离子转运体1有机阳离子转运体2K有机阴离子转运体K多药和毒化和物外排蛋白1A前列腺素转运体U可为后续的毒性研究及临床研究提供重要的理论依据，预测药物可能的相互作致药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADME/T)性质改变。目前报道在药物2001年日本厚生省发布了医药规范第813号省令2006年FDA发布指导原则草案2010年国际转运体联盟(ITC)发表了白皮书2010年欧洲医药管理局(EMA)发布指导原则草案2012年FDA发布新的指导原则草案其中美国FDA在2006年指南中(DrugInteractionStudies-StudyDesign,Data容；2012年美国在FDA指南中又新增了UGTs和6种转运体(BCRP,OATP1B3,OATP1B1,OCT2,OAT1,OAT3)。2010年欧洲EMA在指导原酸盐外排泵转运体BSEP和有机阳离子转运体OCT1,此时药物相互作用研究中转运体总数达到了9种(如表4所示)。胞之间有很好的相关性，所以MDCK细胞也用作Caco-2细胞(最少21天培养),MDCK和LLC-PK1细胞具有培养周期短的优点，只需要5到6天。胞系的应用中，将MDR1基因转染至MDCK中所建立的MDCK-MDR1细胞模单克隆资料来源：药理学报正如上述构建方案图中所述，经过抗性筛选的表达药物转运体的单克隆细胞一般从转录水平、蛋白表达水平和功能水平来验证稳定高表达转运体细胞模型(2)转运体蛋白的表达验证。转运体转录后翻译加工形成蛋白才可以实现外排或摄取的功能。免疫荧光染色法用于转运蛋白定量主要是4.3MDCK-MDR1细胞株的构建及评价每孔10⁵种于六孔板中，培养48h。用LipofectamineTM2000pcDNA3.1-MDR1转染进MDCK细胞内，方法参考检测P-gp的活性(也可采用Hoechst33342外排实验)。另外，也借助RT-PCRMDCK的总RNA,用RT-PCR检测各细胞MDR1的mRNA表达情况。从中可Westernblotting检测P-gp的表达：抽提各单克隆细胞和阴性对照细胞加入含4μmol/LRho123(P-gp的经典荧光底物)的D100min,吸弃上清，用冰冷的磷酸盐缓冲液PBS洗3次，吸净剩余的PBS,每喹啉甲酸BCA蛋白试剂盒检测每个样品的总蛋白量。在P-gp抑制剂对4.3.3MDCK-MDR1细胞株建立的意义及应用相关的方面，还可以进行其他载体转运药物的研究。Luo等研究发现，在MDCK-MDR1细胞中存在Na+-依赖性维生素C转运载体(SVCT),说明转运子如多药耐药相关蛋白MRP、乳腺癌耐药蛋白BCRP等，早在20世纪90年代初，Caco-2细胞胞转运子表达水平影响很大是Caco-2细胞两个突出的缺点，而中的作用，及高表达P-gp的MDCK-MDR1细胞系是一种很理想的评与I型星形胶质细胞(typeIastrocytes,TIA)体外共培养易丢失部分甚细胞是作为BBB药物透过快速筛选的理想模型。Madgula等以和前胡醇当归酯(decursinolangelate)透过BBB的中枢神经系统(cen作用组胺拮抗剂(西替立嗪、氯雷他定)是P-gp的底物，限制了大脑4.4LLC-PK1-BCRP细胞株的构建及其评价筛选了BCRP蛋白的底物和抑制剂以及研究BCRP基因的多态性。4.4.2LLC-PK1-BCRP细胞株的生物学特征及功能性检测Hoechst33342的外排作用，并以GF120918为BCRP抑制剂观察其对BCRP外瞬转pcDNA3.1-BCRP质粒的LLC-PK1细胞)。图中A和C为用Hoechst33342 了很多倍(流式细胞仪分选)。4.4.3