2025年环境微生物实验技能与实践研究报告

《环境工程微生物学》环境水样微生物学指标检测班级：环境131班序言………………错误!未定义书签。试验目的和规定………………错误!未定义书签。采样安排………………………错误!未定义书签。医学院采样点分布图……………………错误!未定义书签。西安工业大学采样点分布图……………错误!未定义书签。医学院采样过程照片……………………错误!未定义书签。西安工业大学采样过程照片……………错误!未定义书签。采样数据登记表…………错误!未定义书签。材料措施……………错误!未定义书签。试验所用重要仪器设备及试剂……………错误!未定义书签。仪器………………………错误!未定义书签。培养基…………………错误!未定义书签。试验原理与环节…………………错误!未定义书签。试验一…………错误!未定义书签。试验三…………错误!未定义书签。试验四…………错误!未定义书签。试验五…………错误!未定义书签。试验六…………错误!未定义书签。成果与分析…………错误!未定义书签。采样记录……………………错误!未定义书签。水样总细菌群落测定…………错误!未定义书签。.大肠菌群检查初发酵成果的观测……………错误!未定义书签。平板分离及革兰氏染色成果记录…………错误!未定义书签。复发酵成果的观测和大肠菌群数目的MPN记录…………错误!未定义书签。大肠菌群数目的MPN记录…………………错误!未定义书签。参照文献……………错误!未定义书签。使用教材及参照书……………错误!未定义书签。——综合试验环境水样微生物学指标检测微生物的分离、纯化、观测、描述，可初步进行鉴定、分类(此步不作规定)。可认为污水、垃圾等生●学习水样的采样措施，采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数；采用多管发酵法(MPN)测定水●成果分析与讨论，经与国标比对检查，水质状况分析。●掌握水中细菌总数测定措施；理解水质与细菌菌落之间的有关性；●掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。1.培养基配制和灭菌2.无菌操作分离纯化3.细菌染色和显微镜使用4.菌落特性观测和描述5.系列稀释措施6.细菌鉴定指标测定时间：11月27日上午(一部分组员采样，一部分组员准备灭菌器具和配制培养基)环节和注意事项：未央校区首3.采样时的照片记录见成果与分析1显微镜2革兰氏染色用有关器材。3高压蒸汽灭菌器。4干热灭菌箱。5恒温箱。6冰箱。7放大镜。8试管、平皿(直径9cm)、刻度吸管等，置于干3伊红美蓝固体培养基0.5%美蓝水溶液13ml时间：11月27日上午1.按照样品采集表(表1)记录样点，编号，采样时间，天气，气温，水位，水质，现场监测项目(pH),采样人姓名。并画出采样湖的平面图，图上时间：11月29日9:00到12:00一.按照每组检测两个水样准备要进行灭菌的玻璃器皿和试剂，包括：试管18支(水样总菌落数测定中稀释6个梯度需5支，两个水样一共10支；大肠菌群检查初发酵试验发酵管需4支，两个水样一共8支);三角瓶2个(水样总菌落数测定中初次稀释需1个，两个水样共2个);移液管10只(水样总菌落数测定梯度稀释需10ml一支，2ml的4支，两个水样共10支);培养皿12个(水样总菌落数测定共涂板3个梯度，每个梯度2个板子，共6个，两个水样共12个);a.供大肠菌群检查之初发酵和复发酵试验的一般乳糖蛋白胨培养液(每只试管5到10mL,一种水样3管，两个水样共6管，加上复发酵需用的，至少准备120mL,可以一次配制300mL,供2组使用);b.供大肠菌群检查之初发酵试验的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液(每只试管5到10mL,一种水样1管，两个水样共2管至少准备20mL,一种班配制200mL<老师指定人员配制>,供所有小组使用);c.供水样总菌落数测定的蛋白胨固体培养基(每只培养皿25mL左右，12个培养皿300mL,每组至少配制300mL)将4支洗净的杜氏小管装入4个试管中，2个水样共准备8支装有杜氏小管的试管，然后在其中的6支中灌入一般乳糖蛋白胨培养液，2支灌入三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液(注意，将大试管倾斜45度左右氏小管中的空气挤压出去，若灌完培养液后仍有气体存在，可以用指头轻弹试管壁将之震出);4.灭菌水的准备，每组至少准备500mL纯净水进行灭菌。1.将配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基和分装好一般乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液灭菌完毕后，一部分人进行水样的梯度稀释(注意，初次稀释要进行大体积稀释，例如将20mL水样加入180mL灭菌水中；每一步稀释都必须保证将水样混匀部分组员进行牛肉膏蛋白胨平板的倒板工作(若选择直接倒板法涂板的可不用进行此部分);稀释用的移液管要编号保留，背面涂LB平板的时候要对将10mL原始水样加入到装有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，1mL原始水样加入1支装有一般乳糖蛋白胨培养液的发酵管中；稀释10¹和10²的水样分别加入装有一般乳糖蛋白胨培养液发酵管中将接种完毕的发酵管放入37℃培养箱中培养24h到48h.从10³到10⁶稀释梯度中选择3个梯度的稀释水样进行LB平板的涂板，措施可选用倒板法(在平板中加入1mL水样后倒入20mLLB培养基(培养基温度必须控制在40℃如下，倒板速度要快，防止倒板过程中LB固体培养基凝固)或涂板法(将1mL菌液加入到制好的LB平板上，再使用涂布器涂匀，涂布器每次使用前都要酒精灯干热灭菌，冷却后再涂板);涂制好的平板放入37℃培养箱中培养24h到48h。时间：11月29日早上9:00到12:00(一部分组员进行试验二的成果观测和记录，一部分组员进行试验四的内容，先制作伊红美蓝培养基，清洗出计数后不用的培养皿(按照初发酵试验成果，有几种阳性成果准备几种培养皿)进行包裹灭菌，和制备好的伊红美蓝培养基一同灭菌)1.水样总菌落数测定成果的观测(记录到表2中)①菌落计数：肉眼观测，可用放大镜，可标识；a.某稀释度的菌落数=两平板菌落数取平均值。b.计数原则：选择菌落数在30-300之间的稀释度●仅有一种稀释度在此范围：总菌落数=菌落数×稀释倍数；●有两个稀释度在30-300之间，两梯度菌落数之比(两个稀释梯度涂板后所长的菌落数的比例)>2,选较小值作为菌落数进行计算，菌落数之比<2,取平均值；●所有稀释度均>300,取稀释倍数最大者的菌落数进行计算；●所有稀释度均<30,取稀释倍数最小者的菌落数进行计算；●没有任何稀释度在30-300之间，选最靠近该范围者；d.稀释度选择及细菌总数成果记录2.大场菌群检查初发酵成果的观测按照表3进行初发酵成果的记录，产气变色、产气不变色、变色不产气和不试验四时间：11月30日19:30到21:00按照书本上的方式配制伊红美蓝固体培养基，按照初发酵试验成果(有几种阳性成果准备几种培养皿)准备所需培养基量(每个平板20-25mL);2.灭菌将准备好的伊红美蓝培养基以及倒平板所需的培养皿(按照初发酵阳性成果数目进行准备);3.倒板将初发酵试验中阳性管中的菌液稀释一定倍后(菌液浑浊度大的稀释倍数合适放大)吸取1mL稀释菌液进行涂板，或者直接使用接种环沾取初发酵阳性菌液进行平板划线，划线方式按图1进板放入37℃培养箱培养24h。试验五时间：12月2日10:00到12:00(一部分组员进行试验四成果的观测和记录并进行革兰氏染色，另一部分组员进行复发酵试验需用的一般乳糖蛋白胨培养液的准备<假如试验二中剩液没有受污染则直接使用，准备复发酵管，并进行灭菌>,之后对灭菌后的复发酵管进行接种)直接准备4个装有杜氏小管的发酵管，按照试验二的简介加入试验二时剩余的一般乳糖蛋白胨培养液(每管5或10mL,若剩余的培养基已经受污染，则必须重新配制)。2.灭菌将环节1中准备好的复发酵管进行灭菌。3.平板分离试验成果观测4.革兰氏染色挑取环节3中的阳性菌落的一小部分进行革兰氏染色(环节如下),记录成果。a.用培养18～24h的培养物涂片，涂层要薄；b.将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去；d.滴加脱色剂，摇动玻片，直止无紫色脱落为止(约20～30s),用水洗去；e.滴加复染剂，Imin后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。5.平板分离及革兰氏染色成果记录平板分离得到的阳性菌落的对应特性按照表4进行记录，并补充革兰氏染色成果。6.复发酵管的接种使用接种环挑取环节4中革兰氏染色阴性的菌落的另一部分，直接接种于复发酵管中，注意做好编号记录，放入37℃培养箱培养24h。内容安排：复发酵成果的观测和大肠菌群数目的MPN记录时间：12月4日8:00到10:00环节和注意事项：按照试验三中环节2的方式进行复发酵试验成果(参照P418页产酸产气状况分析)的记录。2.大肠菌群数目的MPN记录根据环节1的成果，根据附录六表3(P450页),汇报总大肠杆菌群数。表1水样采集登记表(1)西安医学院采样登记表观测项目水样编号1水样编号2水样编号3采集时间采集时温度采集地点ABC水体颜色淡黄色淡黄色淡黄色水体浑浊度轻度浑浊轻度浑浊轻度浑浊水体面积180平米180平米180平米水体漂浮物(有无大面积藻类)无无无水体周围环境(人员流动密度)较多较多较多(2)西安工业大学采样登记表观测项目水样编号1水样编号2水样编号3采集时间采集时温度666水体颜色水体浑浊度轻度浑浊轻度浑浊轻度浑浊水体漂浮物(有无大面积藻类)无无无水体周围环境(人员流动密度)稀少稀少稀少医学院(稀释浓度依次为10-²10³104)平均稀稀菌菌比(个/g或个/ml)(个/g或个/ml)西安工业大学西安医学院.大肠菌群检查初发酵成果的观测初发酵成果(照片)表3初发酵成果登记表1是是是2否否是3否否否阴性(2)西安工业大学2否否是3否否否阴性革兰氏染色成果(照片)西安医学院阳性成果菌落号湿干菌落描述厚或薄大或小松或密大或小边缘隆起形状透明度正面背面水溶性色素透明，半透明所有的菌落厚小无无光滑属光泽圆润圆或者形，突起状深紫黑色深紫黑色无半透明菌落号湿干菌落描述厚或薄松或密边缘隆起正面背面透明，不透明，半透明所有的菌落厚小