《分子生物学实验》基础实验技能培训实验操作手册

基础实松技能培洌

实脍操作手册

实验安排表

时间实验名称主要内容

微量移液器的校准与使用

pH计的校准与使月

上午实验一、基本实验技能

电子天平的校准与使用

第一天常用仪器介绍

8.18液体培养基的配制

固体培养基的配制

下午实验二、基本实验准备

细菌的液体培养接种

实验常用试剂配制等

第二天上午实验三、植物基因组DNA提取植物基因组提取

8.19下午实验四、感受态制备感受态制备

第三天I.T-实验五、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收PCR反应、产物回收纯化

8.20下午实验六、TA克隆-连接转化连接转化涂板

第四天上午实验六、TA克隆•鉴定•菌落PCR签定菌落PCR鉴定

8.21下午实验七、植物RNA提取、逆转录RNA提取逆转录

上午实验六、TA克隆-鉴定-质粒提取质粒提取鉴定

第五天

下午实验八、荧光定量PCR荧光定量

8.22

分子实验总结

第六天上午实验九、蛋白提取、蛋白定量蛋白提取、蛋白定量

8.24下午实验十、蛋白电泳制胶、电冰、染色

第七天

全天实验H--、WesternBlot实验（DAB显色）转膜、封闭、一抗、二抗、显色

8.25

包被、封闭、一抗、二抗、显色、

上午实验十二、ELISA检测

终止

第八天

下午实验十三、细胞培养细胞培养基本方法

8.26

蛋白实验总结

三个实验，DNA、RNA提取、荧光

定量PCR操作。每组派出一个学员

上午综合测试（现场考核操作）

第九天进行抽签，抽到一种实验方案及一

8.27个学员，现场进行操作，结果评比。

下午总结报告评选优秀学员和优秀小组

植物基因组DNA提取

实验材料:

植物样本，植物基因组DNA提取试剂盒，B-疏基乙醇，氯仿，无水乙醇

实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、离心机、研钵、研钵棒、剪刀、天平、液氮

实验前准备：

1.BufferGP1在使用前请加入代疏基乙醇,5mlBu^erGP1加5pl即疏基乙醇。加入p-

筑基乙醇的BufferGP1室温可保存1个月。

2.预热水浴锅65度，珞加入配制好的疏基乙醇预热。

3.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在BufferGW1和BufferGW2中加入无水乙醇。

4.称取植物样本约100mg。

5.在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，放入剪刀、钥匙高温消毒。

6.研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵口以预冷研钵。

实验步骤：

1.取植物新鲜组织约100mg,用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。

将粉末转移到离心管中。

注意：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase

有可能降解基因组DNAo

2.加入700H65℃预热的BufferGP1(BufferGP1在使用前请加入B-筑基乙醇，5mlBuffer

GP1加53小毓基乙醵)，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过

程中颠倒离心管混匀样品数次。

3.加入7007氯仿.充分混匀，12,000rpm(〜13,400xg)离心5分钟。小心将上层水相

转入一新的离心管中，加入700ulBufferGP2,充分混匀。

4.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube)的吸附柱(SpinColumnDM)

中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。10,000rpm(〜11,500xg)离心1分钟，倒

掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

5.向吸附柱中加入500ulBufferGW1(使用前检杳是否"加入无水乙醇)，10,000rpm离

心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.向吸附柱中加入500ulBufferGW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10,000rpm离

心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

(乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂)

8.将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50ulBufferGE,室温放

置2・5分钟，10,000rpm离心1分钟,收集DNA溶液，・20℃保存DNA。

9.电泳检测。

感受态制备

实验材料：

菌株：Top10(Str+)、LB固体培养基，LB液体培养基，洗脱液，保存液

实验方法：Cacl2法制备TOP10感受态

实验仪器、耗材：4度离心机，分光光度计、50ml离心管、-80度低温冰箱

试剂配制方法：

1L液体LB培养基：10g蛋白陈+5g酵母粉+10g氯化钠，加蒸镭水至1000ml。

100ml固体LB培养基：1g蛋白陈+0.5g酵母粉+1g氯化钠+1.5g琼脂粉，加蒸储水至

100mL

1L洗脱液：16.264gMgCI2・6H2。(80mM)+2.94gCaCI2-2H2O(20mM)

200ml保存液：2.205gCaCI2-2H2O(75mM)+30ml甘油(15%)

灭菌条件：122℃20min

实验步骤：

1.菌种的划线培养

第一天下午4:30分

从-80℃取甘油菌，在•次性LB平板上进行划线接菌，在37。(:恒温培养箱过夜培养。

2.接菌小摇与培养基的制备

第二天下午4:30分

取过夜培养平板,用枪头挑菌于50ml液体LB培养管内，37℃,250rpm摇菌过夜。

3.扩大培养

第三天早上8:30分

取过夜小摇菌液按1:100比例加入250ml三角瓶(含100ml液体LB培养基)进行

扩大培养，期间监测OD值。

4.冰冻，离心，收菌

当OD600=0.4~0.5之间时，将摇菌三角瓶置于冰上，冰浴30min。

然后将菌液分别加入50ml离心管中4℃,3500rpm,离心10min收集菌体,

5.洗脱，冰冻，离心

将收集的菌体加入洗脱液12.5ml,混匀，冰浴20min。

(每菌液量加12.5ml洗脱液，也可根据总体积调整洗脱液的大小。)

4℃,3500rpm,离心10min,收集菌体。

6.分装保存

加入保存液5ml(每100ml菌液量)，混匀，分装细胞即可。

PCR扩增

实验材料：

GFP模板（约750bp）,GFPForwardPrimer,GFPReversePrimer,TaqMasterMix

实验仪器、耗材：PCR仪、移液器、PCR管、1.5ml离心管、电泳仪、照胶仪

实验步骤：

1.配制PCR反应体系：

每组做两个重复。

试剂50pl反应体系

2xTaqMasterMix（含染料）25pl

GFPForwardPrimer,10pM1pl

GFPReversePrimer,10pM1Ml

Grp模板1pl

RNase-FreeWater22pl

Total50pl

2.PCR反应条件：

步骤温度时间

预变性94℃2min

变性94MC30s、

退火55℃30sr30个循环

1minJ

延伸72℃

终延伸72℃2min

3.结果检测：反应结束后，取35Hl反应产物电泳检测，并准备进行琼脂糖凝胶回收。

琼脂糖凝胶回收纯化

实验材料：琼脂糖凝胶胶块、琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、无水乙醇

实验仪器、耗材：切胶仪/照胶仪、小刀、移液器、分光光度计、水浴锅、1.5ml离心管

实验前准备：预热水浴锅至50度。

实验步骤

1、取2个1.5ml干净的离心管，称取空管重量，将重星标记于管型上。

2、将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入离心管中，称重，

计算胶块重量。

注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。

3、向胶块中加入3倍体积BufferPG(如凝胶重为100mg,其体积可视为100pl,依此类推)。

4、50℃孵育10分钟，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。如果

还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解

注意；1)当琼脂糖凝胶浓度＞2%时，适当延长孵育时间。

2)胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合

DNA的能力较弱。

5、柱平衡：向已装入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDM)中加入200

plBufferPS,17,900xg(-13,000rpm)离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重

新放回收集管中。

6、将步骤3或4所得溶液加入到己装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，17,900xg

(-13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：吸附柱容积为700川，若样品体积大「700川可分批加入。

7、向吸附柱中力口入5003BufferPG,17,900xg(-13,000rpm)离心1分钟,倒掉收集管中

的废液，将吸附柱放回收集管中。

8、向吸附柱中加入750plBufferPW(使用前请先检杳是否已加入无水乙醇)，17,900xg

(-13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

9、17,900xg(-13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置尸室温数分钟,

以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶

切、PCR等)。为确保下游实验不受残留乙醉的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置

数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

10、将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加353BufferEB

(pH8.5),室温放置2分钟。17,900xg(-13,000rpm)离心1分钟,收集DNA溶液。-20℃

保存DNA。

注意：1）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5

（可以用NaOH将水的pH值调到此范围）。

2）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重复步骤10,

3）洗脱体积不应小于30pl,体积过少会影响回收效率。

4）如果使用TE洗脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。

5）I可收大于10kb的DNA片段时，BufferEB应在50℃水浴中预热，适当延长吸附和洗脱时间，

可增加回收效率。

11、结果检测：

1）浓度检测：对回收后的PCR产物进行浓度测定。

2）电泳检测：取43回收前的PCR产物、2.5川回收前的PCR产物及5川回收后的PCR产物进

行电泳检测。

TA克隆

连接、转化、涂板、鉴定

一、连接：

实验材料：pUC-T载体、回收纯化的DNA片段（750bp）

实验仪器、耗材：移液器、PCR管、PCR仪

实验步骤：

1.计算插入片段的体积；

1）在进行克隆时，载体pUC-T和插入片段的摩尔比一股为1:2-1:10,本实验我们选择1:3。

2）本实验使用的载体pUC-T浓度为50ng/川，50ng的摩尔数约为0.03pmol,因此本实验插

入片段的摩尔数为0.09pmol,插入片段为750bp,那么本实验插入片段DNA的使用量（ng）

=0.09x10-3x660x750（插入片段bp数）=44.55ng。

3）插入片段的体积（3）=插入片段DNA的使用量（ng）/插入片段的浓度（ng/pl）

本次我们使用的插入片段为上次实验中胶回收片段，因此胶回收片段的浓度为40.6ng//，那

么，插入片段的体枳（川）=44.55/40.6=1.097,即在反应体系中加入13插入片段。

2.按以下体系配制反应液：

每组做4个。

试剂体积

pUC-T(50ng/pl)1Ml

插入片段（750bp）Xpl

RNase-FreeWaterYpl

SolutionBuffer,2x5pl

Total103

3.混匀，22℃孵育30分钟，或者16℃过夜连接。

二、转化：

实验材料：TOP10感受态细胞、自制感受态细胞、LB液体培养基

实验仪器、耗材：移液器、超净台、浮漂、摇床、水浴锅

实验前准备：预热水浴锅至42度。

实验步骤：

1.取TOP10感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，进行以下实验。

2.实验组：将103连接产物加入至1003Top10感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀，

冰浴30分钟。每组共做2个。

对照组：将10pl连接产物加入至1003自制感受态纽胞中，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴

30分钟。每组做2个。

3.将离心管置于42℃水浴，热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

4.向离心管中加入900PL的LB液体培养基（不含抗生素）,混匀后置于37℃摇床，150rpm

振荡培养45分钟，使菌体复苏。

三、涂板、培养：

实验材料：LB固体培养基、LB液体培养基、氨苦、IPTG、X-gal

实验仪器、耗材：涂布棒、超净台、移液器、培养箱

实验步骤：

1.倒板：

在LB固体培养基中加入氨节后，进行倒板。

将100mg/mL的氨节稀释1000倍使用。（300ml培养基+300PL的100mg/mL氨苇）

注意！培养基温度应在50-60度时，再加入氨茉。

2.将40PL的20mg/mL的X-gal和20PL50mg/mL的IPTG涂布于含氨茉青霉素的LB平板上，

用无菌的涂布棒均匀涂开。

3.离心，倒掉上清，将沉淀中全部转化后的培养物，加到平板上，用无菌的涂布棒将细

胞均匀涂开。

4.将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平板，37℃培养箱，过夜培养。

四、观察、鉴定：

1.观察蓝色和白色菌落，计算白色和蓝色菌落数。

2.菌落PCR鉴定

实验材料：TaqMasterMix>菌液、M13ForwardPrimer>M13ReversePrimer>LB液体培

养基、氨茉

实验耗材：超净台、15ml离心管、摇床、PCR仪、移液器、LB液体培养基

实验步骤：

选择平板，每个平板挑取白色菌落（4个）和蓝色菌落（2个）,分另ij放入50plRNase-Free

Water中，取23进行菌落PCR鉴定。剩下的48川等待菌落PCR结果，选取阳性克隆，于当

日下午接种于5ml含氨节青霉素的LB液体培养基中，置于37℃摇床，250rpm振荡培养过夜，

用于第二日提取质粒。

1）配制PCR反应体系：

试剂203反应体系

2xTaqMasterMix10pl

M13ForwardPrimer,10pM0.5pl

M13ReversePrimer,10pM0.5pl

菌液2Ml

RNase-FreeWater7Ml

Total20pl

2）配制除菌液外的预混体系，并分装到PCR管中，每个管中加入183的预混体系。

3)模板加入：每个管中分别加入23菌液。混匀，短暂离心。

4)PCR反应条件：

步骤温度时间

预变性94℃2min

变性94℃30s'

退火55℃30s>30个循环

延伸72℃1minJ

终延伸72℃2min

5）结果检测：反应结束后，取53反应产物直接电泳检测结果。

3.高纯质粒提取鉴定

实验材料：菌液，高纯质粒提取试剂盒，无水乙醇

实验仪器、耗材：移液器、电泳仪

实验前准备：

1）BufferP1中力「入RNaseA。

2）第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在BufferPW中加入无水乙醇。

实验步骤：

1.取2nli（根据培养菌体的浓度选择合适的量，建议最多不超过5ml）过夜培养的菌液，加

入离心管中，12,000rpm（~13,400xg）离心2-3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。

注意：质粒拷贝数较低或＞10kb时，可以使用更多菌液通过二次离心将菌体沉淀收集到同

一个离心管中，同时后续所加试剂BufferP1、P2及N3的量需加倍。所加试剂的量

必须能够充分裂解菌体，菌体过多、裂解不充分都会降低质粒的提取效率。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入250ulBufferP1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用

移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

3.向离心管中加入250ulBufferP2,温和地上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放

置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

注意：不耍剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示

可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

4.向离心管中加入350ulBufferN3,立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室

温放置5分钟。12,000rpm离心10分钟。

注意：BufferN3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

5.柱平衡：向已装入收集管（CollectionTube）的吸附柱（SpinColumnCM）中力口人2003

BufferPS,12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.将步骤4中所得的上消液转移到吸附柱（已装入收集管）中，12,000rpm离心1分钟，倒掉

收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的最大容枳为7003，所以第4步中所得溶液分2次过柱。

7.向吸附柱中加入500ulBufferPB,12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附

柱重新放回收集管中，

注意：如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5a,TOP10等），此步可省略。如果宿主菌是

endA+宿主菌（TG1,BL21,HB101,JM101,ET12567等），这些宿主菌含

有大量的核酸耐，易降解质粒DNA.推荐采月此步，如果提取低擀贝质粒推荐采用

此步。

8.向吸附柱中加入600川BufferPW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1

分钟，倒掉收集管中的废液。

9.重复步骤8。

10.将吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5

分钟。

注意；这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的防促反应（酶

切、PCR等）。

11.将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100ulBufferEB,室温放

置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20。（:保存质粒。

注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11。

2）BufferEB在65—70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。

3）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5

范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率。

4）洗脱缓冲液体积不应少「503，体积过小影响回收效率。

12.结果检测：取53产物进行电泳检测。

植物总RNA提取

材料:

植物样本，超纯RNA提取试剂盒，氯仿，75%乙醇(无RNase的水配制)

实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、4度离心机、分光光度计、研钵、研钵棒、天平、

液氮

实验前准备：

1.配制75%乙醇，用无RNase的水配制。

2.称取植物样本100mg。

3.在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，放入剪刀、钥匙高温消毒。

4.研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵中以预冷研钵。

实验步骤：

注意：低温冰上操作

1.样品处理：称取植物样本100mg,将植物样本剪碎后，放入研钵中，加入液氮，充分

研磨，研磨充分后，加入1mlBufferRLT,

注意：样品体积不超过BufferRLT体积的10%。

2.样品中加入BufferRLT后反更吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸

复合物完全分离。

3.每1mlBufferRLT加入200山氯仿的比例加入氯仿,盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放

置2分钟。

4.4℃12,000rpm(~13,400xg)离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和

上层无色水相，RNA主要在上层水相中,将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自

备)中。

5.在得到的水相溶液中加入等体积的70%乙醇(无RNase的水配制)，颠倒混匀。

6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱(SpinColumn

RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的

废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入/00JlBufferRW1,12,。。。rpm离心2U秒，倒掉收集管中的废液，将吸

附柱重新放回收集管中。

8.向吸附柱中加入500HBufferRW2(使用前检杳是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离

心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9.重复步骤8,,

10.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

11.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(CollectionTube1.5ml)中，向吸附柱的中间部

位加入30-50ulRNase-FreeWater,室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA

溶液，-70°C保存RNR,防止降解。

12.检测：

1）电泳检测。

2）RNA浓度和纯度测定：

纯度：OD260,，QD280=1.921<1.8蛋白质或酚类污染>2.2RNA水解

浓度：RNA（且g/旦I）=40*OD26O乂稀释倍数

逆转录CDNA合成

实验材料：

HiFi-ScriptcDNA第一链合成试剂盒，RNA（植物RNA实验提取）

实验仪器、耗材：

PCR仪、PCR管、移液器

实验步骤：

1.将RNA模板、PrimerMix.dNTPMix、DTT、RTBuffer>HiFi-ScriptRNase-FreeWater

溶解并置于冰上备用。

2.根据以下表格配置反应体系，总体积为203。

RNA终浓度建议为印g,需要根据测定的RNA浓度，计算逆转录中需要的RNA体积。

试剂20pl反应体系

dNTPMix,2.5mMEach4pl

PrimerMix2Ml

RNATemplateXpl(1|jg)

5xRTBuffer4pl

DTT,0.1M2Ml

HiFi-Script,200U/pl1pl

RNase-FreeWaterY

Total20pl

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育50分钟，85'C孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

5.逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR,或置于-20℃长期保存。

荧光定量PCR

实验材料:

UltraSYBRGreenMixture,cDNA,actinForwardPrimer、actinReversePrimer

实验仪器、耗材：

荧光定量PCR仪、PCR管、1.5ml离心管、移液器、八连管离心机

实验步骤：

1.模板稀释：

注意：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。

编号模板稀释倍数水用量模板用量

110倍90pl10pl（原液）

2100倍90pl10pl（从1号管取）

2.配制PCR预混反应体系：

做8个样本，配制10个样本的预混体系，配制方式如下:

配制10个样本的

试剂20pl反应体系

预混体系

2xUltraSYBRMixture100pl10pl

ForwardPrimer,10pM4pl0.4pl

ReversePrmer,10pM4pl0.4pl

AcDNAOpl2Ml

RNase-FreeWater72pl7.2pl

Total18020

3.将配制的预混体系，分装到八连管中。共8个孔，每个孔中加入183的预混体系。

4.模板加入：

每个孔中分别加入2「模板，加样顺序如下:

加样孔12345678

样品原原稀释稀释稀释稀释水水

液液10倍10倍100倍100倍

加入体积2pl2pl2pl2pl2pl2pl2Pl2Ml

5.混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

6.荧光定量PCR反应程序:

步骤温度时间

预变性95℃10min

变性95℃10sI

40个循环

1min)

退火/延伸60℃

融解曲线分析

注意事项：

1.首先配制预混体系，再将预混体系分装到八连管中。

2.稀释模板时，需要混匀。

3.不要直接在八连管管壁或管盖上做标记！

植物总蛋白提取

实验材料：植物样本、植物蛋自抽提试剂

实验仪器、耗材：研钵、研钵棒、移液器、1.5ml离心管、4度离心机、天平、液氮

注意：低温冰上操作

实验前准备：

1.将蛋白酶抑制剂混合物加入植物蛋白抽提试剂中，按照1:99比例加入，使蛋白酶抗制剂

混合物在抽提试剂中成1x工作液。

配制方法：990川植物蛋白抽提试剂+10川蛋白能抑制剂混合物，冰上放置待用。

2.称取植物样本约100mg。

3.在研磨植物材料前，先将液氮加入在研钵中以预冷研钵。

实验步骤：

1.称量100mg植物组织，用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。

将粉末转移到离心管中。

2.按照组织：抽提试剂=1：5(g/ml)的比例加入蛋白抽提试剂，100mg植物组织加入5003

蛋白抽提试剂。涡旋混匀，冰上孵育30分钟，期间涡旋混匀3次。

3.4℃12,000rpm,离心20分钟。

4.将上清转移至新的离心管中。冰上放置，准备蛋臼定量，或将提取的蛋白-20℃保存。

蛋白定量

实验材料：提取的植物蛋白、BCA定量试剂盒

实验仪器、耗材：移液器、酶标仪/分光光度计、酶标条、酶标板、1.5ml离心管、PCR管

实验步骤：

1.标准品稀释（按照下表进行标准品稀释）。

管号稀释液用量（U1）标准品用雷（ul）最终浓度（ugml）

A01002000

B2002001000

C200200（从B管中取）500

D200200（从C管中取）250

E200200（从D管中取）125

F400100（从E管中取）25

G20000（空白）

3.配置BCA工作液：根据标准品和样品的数量，将试剂A和试剂B以50：1的体枳比

混匀（6mlA液+120plB液）

微孔法：

1）将253稀释好的样品与稀释好的标准品分别添加于96孔板的微孔中。

2）各孔中加入200plBCA工作液，充分混匀。

3）盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟。

4）冷却至室温。

5）用酹标仪测定562nm处的吸光值。

6）绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

试管法：

1）将1003稀释好的样品与稀释好的BSA标准品分别加到作好标记的试管中。

2）各试管中各加入2mlBCA工作液，充分混匀。

3）37℃水浴中孵育30分钟或室温孵育2小时。

4）将各管冷却至室温。

5）用分光光度计测定562nm处的吸光值。

6）绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

注意事项：

标准品测定需在10min内完成，否则会影响蛋白定量的准确度。

蛋白电泳(制胶、SDS-PAGE电泳)

实验材料：

SDS凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预

染中分子量蛋白Marker、SDSLoadingBuffer:还原，5x)、G250蛋白快速染色

试剂、若干蒸储水

实验仪器、耗材：

蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管

配制溶液：

•配制10%APS溶液：-20度保存

0.5gAPS+5ml蒸储本、2.5gAPS+25ml蒸储水

•配制200ml电泳缓冲液：CVV0045Tris-GlycineSDS(ph8.3,10X)

2()mlTris-GlycincSDS+180nil蒸储水

•配制1mlloadingbuffer：

200ul5Xloadingbuffer+800ul蒸储水

实验步骤：

一.制胶：

1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。

SDS分离胶的浓度与最佳分离范围

SDS分离胶浓度最佳分离范围

6%胶50-150kD

8%胶30-90kD

10%胶20-80kD

12%胶12-60kD

15%胶10-40kD

3.配制10%分离胶：

将不同体积的30%Acr-Bis(29:1),分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。

加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

配制SDS分离胶

分离所需各组分体积(单位：ml)

凝胶

胶浓30%Acr-分离胶缓汨液

体积双蒸水10%APSTEMED

度Bis(29:1)(4x)

10%5ml2.081.671.250.050.002

10ml4.173.332.50.10.004

15ml6.255.03.750.150.006

20ml8.36.750.20.008

4.待胶濯至距离玻琏板顶端1.5cm的时候停止灌狡，加入蒸储水水封。静置40分钟

至1小时。

5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸储水，用滤纸将水溶液吸干。

6.配制5%浓缩胶:

配制5%SDS浓缩胶

所需各组分体积（单位：ml）

凝胶

30%Acr-Bis(浓缩胶缓冲液10%APTEME

体积双蒸水

29:1)（4x）SD

2ml1.140.340.50.020.002

4ml2280.6810.040.004

6ml3.421.021.50.060.006

8ml4.561.362.00.080.008

7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

注意：灌胶速度要快，防止凝胶。

8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。

9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。

二.SDS电泳：

1.在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。

2.制备样品：

1）植物蛋白样品：

根据植物蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。

蛋白提取液+5x上样缓冲液+蒸储水

制备的样品，煮沸5分钟，12,000rpm离心5分钟，取上清，上样。

2）全细胞裂解液：可以直接上样，上样203，约40ug.

3.上样：K562全细胞裂解液上样顺序如下：

泳道12345678910

样品1x上样Marker样品样品样品样品样品样品样品1x上样

缓冲液1234567缓冲液

体积10pl5pl20320pl20pl20pl20川20320川10pl

4.电泳：浓缩胶80V,约20分钟，分离胶100V,约1小时。

四、考马斯亮蓝染色

注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行

westernblot检测。

1.将电泳后的PAGE胶取出放入容器中，加入适量蒸偏水（以充分覆盖PAGE胶为

宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸储水：

2.加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液;

3.加入适量蒸储水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸储水，重复此步骤至背景清晰。

4.观察拍照。

WesternBlot

溶液配制：

•配制500ml1XTBST溶液：

50mlTBST（ph8.3,10X）+450ml蒸储水

•配制100ml5%牛奶封闭液：4度保存

5克脱脂奶粉+100ml1XTBST

•配制100ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044Tris-Glycine（ph8.3,10X）

1（）mlTris-Glycine+20ml甲醇+70ml蒸锵水（4度保存）

一.转膜及染色

实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂

实验仪器、耗材：转膜仪

实验步骤：

1.电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。

2.用剪刀剪相同大