DB37T 3112-2018 猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术

ICS65.020.30DB37DB37/T3112—2018猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术山东省质量技术监督局发布IDB37/T3112—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、张玲玲、郑书轩、徐绍建、孙文博、于江、丛晓燕、韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。1DB37/T3112—2018猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术本标准规定了猪伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测技术的操作步骤。本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义3.13.2嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。3.33.4无毒型核酸染色剂。4材料及设备4.1主要仪器设备4.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。4.1.220000r/min低温高速离心机。2DB37/T3112—204.1.3电热恒温水槽。4.1.4稳流稳压电泳仪。4.1.5水平电泳槽。4.1.6凝胶成像系统。4.1.7紫外透射反射分析仪。4.1.8电磁炉。4.1.9烧杯(1000mL)。4.1.10电子天平精度为：0.001g。4.2主要试剂或材料4.2.15mol/LBetaine溶液：配制见附录A.1。4.2.2BstDNAPolymerase(8U/μL)。4.2.3SYBRGreenI核酸染料。4.2.52%琼脂糖电泳液：配制见附录A.3。4.2.64SGreenPlusNucleicAcidStain。4.2.7DNAMarker2000。4.2.9超纯水：符合GB/T6682,三级。F3:5'-ACGAGCCCCGCTTCCA-3'。B3:5'-AGATGCAGGGCTCGTACA-3'。5检测步骤5.1样品采集与处理采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。5.2样品处理5.2.1血清直接用于DNA提取。5.2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1:5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000r/min离心15min,取上清液-20℃保存备用。5.3病毒DNA的提取水浴2h～3h。5.3.2加入200μLTris饱和酚，混匀，4℃12000r/min离心15min。5.3.3取上清液500μL,加入200μLTris饱和酚和200μL三氯甲烷，4℃12000r/min离心3DB37/T3112—20185.3.5取上清液300μL,加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,4℃12000r/min离心15min。5.3.6弃上清液，加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。5.4.1环介导等温扩增反应体系配制，按表1中1～8的循序配制。体系组成体系含量110×ThermoPol2dNTP混合液(10mmol/L)34BIP/FIP(50μmol/L)5Betaine(5mol/L)6DNA7BstDNAPolymerase(8U/μL)8超纯水5.4.2LAMP程序设定表2LAMP反应程序设定温度时间160min25.5.12%琼脂糖凝胶板的制备(见附录A.3)。5.5.2加样混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA保持稳定电压80V,电泳20min,观察结果。在试验成立条件下，出现瀑布样条带泳道的样品判为阳性(说明样品中含有猪伪狂犬病毒),不出现瀑布样条带泳道的样品为阴性(参见附录A.5)。4DB37/T3112—206.2可视化结果判定6.2.1LAMP反应体系中加入1μLSYBRGreenI核酸染料，混匀(加深观察颜色),阳性反应管内液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色(参见附录A.6)。6.2.2反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光(参见附录A.7)。5DB37/T3112—2018(规范性附录)试剂的配制灭菌超纯水2.5mL。A.20.5×TBE缓冲液Na2EDTA.2H20硼酸55g。灭菌超纯水定容至1L,配成10×TBE缓冲液。A.32%琼脂糖电泳液琼脂糖0.5×TBE缓冲液灭菌超纯水定容至mL,加灭菌水475