DB37T 3104-2018 向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

ICS67.060DB37/T3104—2018向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准山东省质量技术监督局发布IDB37/T3104—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。本标准为首次发布。1DB37/T3104—2018向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准产物检测等技术要求。本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB3543种子检验技术规程GB20464农作物种子标签通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1杂交种各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。3.2品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.3标准样品能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。3.4引物2DB37/T3104—20185仪器与试剂5.1仪器5.2试剂6.230%凝胶溶液至1000mL,4℃贮存备用。6.4催化剂3DB37/T3104—20187.1DNA提取提取液，提取时间1min~24h均可，使用前混匀、静止5分钟、离心3000rpm,0.5min,取上清即为7.2扩增体系a)预变性(94℃,5min);b)第一段循环(循环数：3)命名为“逐一退火循环”:变性(94℃,40s);按照未加通用接头前的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为20s;延伸c)第二段循环(循环数：28～32,通常为30个循环):变性(94℃,40s);将退火和延伸过程合并(70℃,50s);d)终延伸(72℃,10min)。引物选择参考附表，每个杂交种选择3~5对亲本有差异的引物扩增。将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取20mL5×TBE,30mL30%Acr,50mL去离子水于烧杯中，加800uL～1000uL的10%APS,80uL～100uLTEMED混匀，灌7.4.2点样用微量移液器取2ul体系加入样品槽，每加一个样品后，清洗移液器两次，区分不同引物加marker。加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，将电源线正极接下槽，负极接上槽。接通电源，180V稳压电泳2.5h。显色液500ml(2%氢氧化钠，用时加入甲醛2ml),水平摇床至显色为止，倒掉显色液，加入去离子4待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性。对检测的SSR引物双亲谱带同时出现的为本品种，只有某一亲本谱带为亲本，谱带与双亲位置有差异的籽粒为杂粒。8结果计算计数供检样品粒数(N)和非本品种粒数(M),并按式计算电泳测定值X%(保留一位小数)。X(%)=(N-M)/N×1009结果报告按照GB/T3543,写明对照样品名称，使用的亲本有差异的引物数量，检测粒数，纯度%。对送样样品的检验需注明：“结果仅对样品负责”;监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。5DB37/T3104—2018(规范性附录)引物及其参数表A.1规定了标准中引物及其参数。引物名称序列(5'to3')Tm退火温度ORS928-FCATGGTTATTTTGGTTTGGGTTTORS928-RGCTATTATCATGTCCTTGTCCTTTTORS613-FGTAAACCCTAGGTCAATTTGCAG55(+2、+1)ORS613-RATCTCCGGAAAACATTCTCGORS543-FCCAAGTTTCAGTTACAATCCATGAORS543-RGGTCATTAGGAGTTTGGGATCAORS694-FCCTGGAACTGAACCGAGAAC59(-1、+1、+2)ORS694-RGCCGTGAAACAGAGAGAGGAORS956-FGGACCAGATTGCTTCCTAGACTT60.2ORS956-RTCAACATGCGTGATTATTGTTTGORS483-FCCGAACAACAATCTCCACAAORS483-RGGTTTAGGTGTCGCATCACAORS925-FATGATTCTAAGTTGCGGTAGTGCORS925-RGTTGGGTTTAAGTTGTTGCTTCCORS1025-FGACATGGCTTGAACATTTGATTAORS1025-RTCTTATATGCACATCAGTACAAGTCTCORS1021-FAACCCTAATCCAACCAGATACGAORS1021-RTACCACCAGCTCATCCTTAACCT60.2ORS1079-FTACGACTGACGATTCCATTTCTCORS1079-RAACTGGATTTCACAGGGAGTGTTORS1256-FGATGTTGATGTTGGTGAAGTTGCORS1256-RCTCCGTCACCTTAAGCACTTGTA60.2ORS409-FTCCCAGACTAGAGATCGACCA60.0ORS409-RAAACTCAAGGGACTAAGGTTGCORS1108-FACCACACTTATCCAAAGGTTTAAGG58(-1)ORS1108-RCGTGAGAGTAGTTACGAGAAGGAGA62.06DB37/T3104—2018引物名称序列(5'to3')退火温度ORS727-FGGTGGCAAGTGGTGGTTAGAORS727-RAAAGCTGGTCATCTCAAGGGTAORS801-FCCATCTTGGACGCACATCTAORS801-RGAACCACCCGATCATATCCAORS366-FAACCAACTGAGCATTCTTGTGAORS366-RGCGCTAGGTTAAAGAGGACAAAORS331-FTGAAGAAGGGTTGTTGATTACAAGORS331-RGCATTGGGTTCACCATTTCTORS1065-FACCGCTGTCAACACCTTAAACTC60.259(-1)ORS1065-RGGCTGGGAATCAACTGCTACTAC62.0ORS885-FAATGTAAGCCAGAATCCCAAATGORS885-RCCTTCGTCGTTTCCAAGTAGATTORS1088-FACTATCGAACCTCCCTCCAAAC60.1ORS1088-RGGATTTCTTTCATCTTTGTGGTGORS1141-FCGCATATGGGAACGTATACACAC60.256(-1)ORS1141-RTGAAACTGAACACAAGGCATACAORS565-FTGGTCAACGGATTTAGAGTCAAORS565-RTCCAGTTTGGTCTTGATTTGGORS621-FCGCCTTATGCTGAGAGGAAAORS621-RCCTGAAGCGAAGAAGAATCGORS785-FCAAAATACCCAGGTCAAAGCA55(+2)ORS785-RCCTAGCTTATGGGACGTATGGA60.1ORS1242-FGCAATCGTTTCACTCTTCCATTCORS1242-RTGGTCGTAGAATTGTCGGTCATORS1036-FCCCTTTCACTTCCTATTTTCTATTCA56(+2、+1)ORS1036-RCTAAGAGGGGTCGGTATGATTTC60.2ORS512-FCACTCTTGATTAATCACAGTATCTTGCORS512-RGCAGGGACCAATGTTGTCATAORS78-FGTTCGTCGAGTACATGTTCTGC60.1ORS78-RTTTCCCTCTGGAAAGTTGTCAORS844-FACGATGCAAAGAATATACTGCACORS844-RCATGTTTAATAGGTTTTAATTCTAGGGORS695-FTCACCTCATTCTTCACTTTCCAORS695-RTTGGTGGTGGCAGCTATGTAORS537-FTTCTCCCCAAAAACATTCCAORS537-RAAAGAGGAGGCTTGATGATGA7DB37/T3104—2018表A.1引物及其参数(续)引物名称序列(5'to3')Tm退火温度ORS70-FGACCCTGGTCACCGAAGTTA54(-1)ORS70-RATCTGAAATCGGACAAGATTCAORS505-FGTGCGTTGGCTCTTATGGATORS505-RAGTGATGGCATTCCCAATTTORS456-FCCAAGGAATTCTAACAAGAGTTTAAGORS456-RGATTTCTCACTTCACTCCTCTATGC60.3ORS966-FTCAAAGATGTCACCATAGGAAAGAORS966-RATTTGCTGAGACCATGAGCATCORS946-FCAAAACCAGCCATCTATCTCTCTTC60.3ORS946-RTTTGTGGGTCTCTCTCTACAAGGTT60.3ORS716-FCCCCACAACCCATAGCCTAAORS716-RGAACTAACCGCCATCCAAGAORS316-FTGGCGTCTTCATAGCATCAGORS316-RGAGATTTGAGCTTCGTGTTGCORS938-FACCAACTCCCATGCAACCTAAORS938-RGCGTTCTCACCGTTCTAACACTT60.2ORS381-FCCAACGGTGATGTAACTAGGAAORS381-RGTTCTCCTGGATAGCTCGACA60.0ORS1073-FAGAGTGTTGGTCTTGATTTGTGGORS1073-RAAAGAAAGGCGCACGTTAGTCORS965-FTTGGATTACCTTGGATAGTCAGCORS965-RCTTACCCTCCTCAGACCCTACCT63.7ORS12-FGCTTTGAGAAACCGCTTCACORS12-RTTGATATGGTAACTAACGAACACAAORS836-FCACGAAATCGTTCCATTATTATGTTORS836-RGCAAGATAGTTTGATCAGGTAGCAAORS561-FCTTTGCACGTTGGTCATCATORS561-RACCAGCACCTTCCTCAACTGORS595-FTGATGGTAATGCATCGGGTAORS595-RCACACCATCCCTTGTAAAATCAORS725-FTCCGACGACCAAAGAAACTTORS725-RCACAATGAAGGGAAATGGAGAORS1064-FTGAATGATCTATGAGTGGTGATGGORS1064-RACTCGCAGTGGTAAGTCGTTAGG62.0ORS899-FGCCACGTATAACTGACTATGACCA60.3ORS899-RCGAATACAGACTCGATAAACGACAORS1120-FTAACGTGTGCAGGTCTGTCTAAAORS1120-RTGCAAATAATAAGATAATGACCGATT8DB37/T3104—2018表A.1引物及其参数(续)引物名称序列(5'to3')Tm退火温度ORS665-FGCACATGAGGTATGGATCTCCT60.1ORS665-RTGCAAATACAACTCGGGAAAORS420-FTCATGGTGTTTGGTTTGTGTCORS420-RTGCCAAATTCCTCTTCTTTCTORS432-FTGGACCAGTCGTAATCTTTGCORS432-RAAACGCATGCAAATGAGGATORS1086-FTTGTTTGTCGCACACTCAAGATTORS1086-RATTATCGGCACATCTTTGGATTTORS610-FTTGTGACCTTCTCCCTGCTCORS610-RAGGAAGCGAAACGAGGAAGTORS878-FTGCAAGGTATCCATATTCCACAAORS878-RTATACGCACCGGAAAGAAAGTCORS530-FCACTTCATCCTCTCCCTCCTT60.0ORS530-RGGCGTGTGTGTTGGGTTATTORS795-FCGCTAGTTACACCGCAGATGORS795-RTGTCCACAGGTTGAAGATCGORS503-FTGAACCTTCAAACTTGCAATCAORS503-RAAACACACAACACAGGCAAGAORS644-FTCTGCGATACACACATCCAAAORS644-RGGGCTGTTAAAGGTGAGATTCAAORS588-FCGGTTCTCTTTCTCACCTCAAORS588-RTCTCCCGTTCGGACTTCTCORS1178-FAGCTGACCATGTAAGGTTTGGTTORS1178-RATTGTTGAGAGACGAGATGGATGORS691-FGCATCTGAGCAACTGCGTTAORS691-RACCGTCCTTAGCTCTTGTGAG60.0ORS552-FCCATCCCTTCCCTCTCTTTCORS552-RGTGGCTGGAATCTCATCACCORS1187-FAAAGATGTCAGTTTGTCCGTGTCORS1187-RCATCCACATTTCCCTTACACTCAORS1245-FGAAGTGGAGCAATGTTGGTGAORS1245-RCGCCAAGATATTAGTGTGATGATTORS1114-FAGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG60.2ORS1114-RGCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT60.2ORS733-FTATGAGTTGGCAAGGGCTTCORS733-RGGACTCCAACGAGAGAATCAGT60.1ORS10-FCTCCACCACACAATCTCCGORS10-RTGTGGAGTTTGCCAGAACTG9DB37/T3104—2018表A.1引物及其参数(续)引物名称序列(5'to3')Tm退火温度ORS340-FGGGCATAGTTTCCTCCGTTTORS340-RAAGTTCTCACGGTTCTTACAACTCORS1146-FGGCTCATCACTTGCATCTATTGTORS1146-RTGAAGACACCATCTCCAATGCORS397-FCAAAGTCCCAAACCACAACCORS397-RGGGAAACAAGTTCCTTGATGGORS995-FCATGCTTTCTAGGATGGTCAGTTORS995-RTGTATGTGGAGGCCAACAAGTATORS799-FTCCAGCAAGTCAGCAACAACORS799-RACTCCCTCCCATTCTCGTCTORS386-FTCCAGTTATCCAAAGGTGTGCORS386-RGTGCTAGAAGAACCTGTAACCATTORS1237-FTTCCAGAAATTGGAGAGCAAA53(+1)ORS1237-RGATTCTTAGCAAACGCAGAGGORS342-FTGTTCATCAGGTTTGTCTCCAORS342-RCACCAGCATAGCCATTCAAAORS351-FTGAAACGTAGTAACCTGCCAAAORS351-RTTGGACGACCTCGGTATCTTORS547-FTTGTCTTCATCTGCGTGTGAORS547-RTTGCTGTTGTTGATCGGTGTORS677-FTCCTTCCTTCATTCTCTGCATTORS677-RCTCCATACCGTTGCCATCATORS1179-FGATTCGGAGCTGTTAGGAGGTAG62.0ORS1179-RAAACGGGAAGCAAGAATAGAACAORS510-FCATCGCGTCCCTCTCTCTAA57(-1)ORS510-RCCAACCATCACAGCAATCAGORS911-FAAGGATCACTGGAAGAACAATGG57(-1)ORS911-RTAAACGCTTGTGACGGTTAGTTGORS423-FTCATATGGAGGGATCTGTTGG54(-1)ORS423-RAAGCAACCATAATGCATCAGAAORS4-FACAAGTCGGCTGGTGAGCORS4-RACATGAAACACGAGCTAAACCORS810-FTTCAACGTGCGTGATTAAGGORS810-RGCGATTTCTTTGGAGACGAAORS57-FTTCCATTTCCACCATTTTGGCORS57-RCATTCATGGCCTAAAAGGTTCORS1030-FCCTTTGATGTAGTTAAGGAAGTTGTG56(-1)ORS1030-RCGATCAATTTATATGACCGAATTAC