DB37T 2307-2013 长蛸(种质)　规范

ICS65.150B51DB37SpeciesidentificationofOctopusminor山东省质量技术监督局IDB37/T2307—2013本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：马山集团有限公司、中国海洋大学。本标准主要起草人：郑小东、王培亮、李琪、李开锋、钱耀森、于瑞海、左仔荣、常忠岳、崔玉龙。1DB37/T2307—2013长蛸(种质)本标准规定了长蛸(Octopusminor(Sasaki,1920))的名称与分类、主要生物学性状、生长与繁殖、遗传特性及检测方法。本标准适用于长蛸种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分:抽样方法GB/T18654.13养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析3名称与分类3.1学名长蛸Octopusminor(Sasaki,1920),Octopusvariabilis(Sasaki,1929)为其同物异名。3.2分类软体动物门（Mollusca），头足纲（Cephalopoda），八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸属（Octopus）。4主要生物学性状4.1外部形态特征4.1.1外形胴体长卵形，胴长约为胴宽的2倍；体表光滑，具极细的色素色斑。长腕型，腕长约为胴长的6-7倍，各腕长度不等，第一对腕最长也最粗，其腕径约为其他腕径的两倍，腕式为1＞2＞3＞4，腕吸盘两行，基部为一行。雄性右侧第3腕茎化，甚短，仅约为左侧对应腕长度的二分之一；端器匙形，大而明显，约为全腕长度的六分之一。长蛸外部形态见图125.1生长5.2繁殖5.2.1一年性成熟，繁殖期间有短距离洄游。5.2.3繁殖水温：20℃~26℃,最适水温22℃~24℃。5.2.4怀卵量：全长540mm~560mm雌体，怀卵量80～140个左右。6遗传特性3图4长蛸同工酶SOD酶谱图6引物0M09扩增长蛸肌肉组织DNA的凝胶电泳图谱4DB37/T2307—20137.2.2分析样品的制备电泳前取0.3g样品放入1.5ml离心管，加入等体积的提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4℃、12000rpm的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。7.2.3凝胶制备加淀粉30g和制胶缓冲液254ml，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，抽气，然后注入制胶模具中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。7.2.4电泳步骤用手术刀在凝胶距离边三分之一（约2.5cm）处切开，用适当大小的滤纸片蘸取样品提取液放入切口中。上样完毕后，用滤纸搭盐桥，在4℃条件下以40mA稳流进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.2.5染色、固定电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒入染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。待酶显示足够的活性后，用10%的冰醋酸溶液终止反应。各种酶的染色液见附录C和附录D。7.2.6制干胶片取凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干，编号保存。7.2.7摄影、扫描用近焦镜头对凝胶及其谱带照相，或用扫描仪对干胶片电泳谱带进行扫描。7.2.8结果分析判定按GB/T18654.13的规定执行。7.3微卫星DNA分析7.3.1基因组DNA的提取取长蛸肌肉0.1g，切碎至糜状，加入500μlCTAB裂解液，加入20μlproteinK酶，混合入1.5ml的离心管，55℃裂解过夜。7.3.2引物序列引物序列见表17.3.3PCR反应体系5DB37/T2307—201310μl体系组分见表2表210μl体系组分HO7.3.4PCR扩增条件94℃预变性3min,94℃变性1min,Ta（OM07：64℃;OM09：56℃)1min，退火30s,72℃延伸30s,38个循环，循环结束后72℃延伸5min。7.3.5聚丙烯凝胶酰胺电泳1000ml的聚丙烯凝胶酰胺胶液配方:尿素(mw60.06)420g，丙烯酰胺57g，N,N-甲叉3g，10×TBE120ml，灭菌双蒸水定容至1000ml。PCR产物用6%的变性PAGE电泳，银染显色，冰醋酸固定，烘干以读取数据。6DB37/T2307—2013（规范性附录）制胶缓冲液的配制A.1CT-7.0制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1.09g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.2CT-8.0制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1.21g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.3CAPM-7.0制胶缓冲液柠檬酸0.42g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。7DB37/T2307—2013（规范性附录）电泳缓冲液配制B.1CT-7.0电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷16.35g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。B.2CT-8.0电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷20g，用柠檬酸调至pH8.0，蒸馏水定容至1L。B.3CAPM-7.0电泳缓冲液柠檬酸8.4g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。8DB37/T2307—2013（规范性附录）染色缓冲液配制C.10.2MTris-HCl,pH8.0三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.0，蒸馏水稀释至1L。C.20.2MTris-HCl,pH8.5三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.5，蒸馏水稀释至1L。C.30.1M磷酸缓冲液，pH7.0磷酸氢二钠17.