动物细胞的大规模离体培养技术

动物细胞的大规模离体培养技术引言动物细胞培养方法、工艺及控制动物细胞大规模培养反应器及改进动物细胞的高密度培养引言基本概念发展简史微生物与动物细胞的差异动物细胞大规模培养的应用引言动物细胞大规模培养技术（large-scaleculturetechnology）

人工条件下，动物细胞在反应器中进行大量地、高密度培养，以生产珍贵生物制品的技术。pH温度溶氧发酵工艺等条件发展简史1907Harrison创立了体外组织培养技术；

1951Earle开发动物细胞体外培养合成培养基；1957Graff应用灌注技术，培养密度达1010个/L；1962Capstick成功实现小鼠肾细胞的大规模培养，标志着动物细胞大规模培养技术的开始；1967VanWezel成功地以DEAE-SephadexA50为载体，实现动物细胞的载体培养；1975Kohler和Milstein成功建立单克隆抗体技术；1975Sato用激素代替血清使垂体细胞株在无血清介质中生长成功，预示无血清培养的诱人前景；1986DemeBiotech公司首次成功地用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体；1989Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制技术，更新培养工艺的优化控制理论。发展简史微生物与动物细胞差异细胞壁生长速率0.1-0.5h-10.01-0.05h-1需氧量CO2需求营养要求环境影响生长浓度109－1010/ml106/ml大小100－2000nm10－100um动物细胞培养技术应用疫苗生产上的应用已实现商业化生产的产品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、骨髓灰质炎病毒疫苗、牛白血病疫苗干扰素生产上的应用自1957年发现干扰素以来，经历了自然干扰素、基因重组干扰素和蛋白质工程干扰素等3个发展阶段。英国Wellcome公司为了满足临床实验的需要，采用8000LNamalwa细胞生产α干扰素。DMEM培养基胎牛血清其他成分锥形瓶逐级放大培养加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口收获病毒Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺单克隆抗体生产上的应用应用动植物细胞生产单克隆抗体是一条经济、可靠的途径。英国Celltech公司采用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体；国内也已成功地应用中空纤维培养系统和微载体培养动物细胞生产单克隆抗体作为血型定型试剂。其他基因重组产品生产上的应用细胞能精确地转录、翻译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质；可以简化蛋白质的分离提纯；美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生长激素等。动物细胞培养方法工艺及其控制环境系统培养系统反应器提取系统①温度细胞体外生存的基本条件之一；不同源细胞，最适生长温度不尽相同，昆虫细胞25℃-28℃，哺乳动物细胞37℃；低温耐受力强于高温；动物细胞培养的温度允许波动的范围在±0.25℃。1、动物细胞培养的环境动物细胞培养条件②pH合适的pH是细胞生存的必要条件之一。开始培养时培养液的理想pH为7.4，随着培养的进行，pH会因细胞代谢所释放的CO2而下降，但必须控制在7.0以上。大规模培养时，影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：缓冲液的缓冲能力及种类；对流空间大小；葡萄糖浓度。

磷酸对动物细胞有毒害作用，常用的缓冲系统是NaHCO3/CO2。调节培养液pH的方法：A、添加NaHCO3缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节；

B、用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl进行调节。

利用酸碱直接调节会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生毒害作用。2、营养成分细胞的生长、繁殖以及产物的合成都必须从环境中摄取各种营养物质以合成细胞物质及在新陈代谢中起调节作用。这些营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量元素、生长因子，等。3、溶解氧氧气是细胞代谢所必需的。一般在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，当细胞增多时溶氧的水平代谢将受到阻碍；而溶氧浓度过高又对细胞产生毒害作用，使细胞的代谢受到抑制。影响溶解氧的因素：①通风与搅拌②罐压③培养液的理化性质④反应器的结构及空气分布器⑤传递推动力4、渗透压等其他因素渗透压、血清、剪切力等动物细胞有很大的影响。动物细胞大规模培养用培养基天然培养基合成培养基天然培养基天然培养基是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自动物体液或从动物组织分离提取而得；类型①血清优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。②血浆容易发生液化，目前已很少单独使用，一般是禽类血浆。③组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），有促进细胞生长的作用。④水解乳蛋白由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。合成培养基既能提供一个近拟于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。

合成培养基种类很多，但一般都含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些辅助性成分。根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。主要营养成份①氨基酸合成培养基的主要成分，以必需氨基酸为主，一般细胞仅能利用氨基酸的L－型同分异构体。几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。②维生素维持细胞生长的一种生物活性物质，它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢有重大的影响。③糖类主要是葡萄糖，通过糖酵解形成丙酮酸，并可转化乳酸或乙酰乙酸进入柠檬酸循环形成CO2。对胚胎细胞和转化细胞，乳酪在培养基中的积累特别明显。④无机离子⑤其他成分代谢的中间产物氧化还原剂三磷酸腺苷辅酶A等成分。细胞的重要组成部分之一，参与细胞的代谢活动。培养基中无机离子除K＋、Na＋等外，还含有Fe2+、Zn2＋、Cu2＋等微量离子。常用的合成培养基较为常用的有199培养液、Eagle（MEM、DMEM）、RPM1640、HAM培养液等。随着细胞培养技术的发展和应用范围的扩大，对各种培养的要求也越来越严格，多数人工合成的培养基都要加入不同浓度的血清才能培养细胞。无血清培养基血清的成分非常复杂，对一些要求较高的基础性研究的结果影响较大；血清中也含有一定的毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响某些细胞功能的表达；无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的补充因子组成。动物细胞发酵工艺分批式流加式半连续式连续式灌注式细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断地加入反应器内，另一方面又将培养液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于不断的营养状态中。不同培养工艺对tPA（人组织型纤维蛋白溶酶原激活剂）的产量和活性的影响培养工艺分批培养半连续式培养灌注培养纯化利率%82165纯化物质的相对产量11.337.74比活性（IU/mgtPA）114.4391.3392.6动物细胞大规模培养反应器及改进一动物细胞大规模培养用生物反应器满足：低剪切力、良好的混合状态、合适氧浓度、等。20世纪70年代以来，动物细胞大规模培养用生物反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模越来越大。动物细胞培养用生物反应器类型悬浮培养反应器贴壁培养反应器包埋培养反应器搅拌反应器搅拌反应器（微载体培养）流化床反应器气升式反应器玻璃珠床反应器固定床反应器中空纤维反应器中空纤维反应器

陶质矩形通道蜂窝状反应器陶质矩形通道蜂窝状反应器

动物细胞培养反应器1、搅拌罐式生物反应器与传统的微生物反应器相类似，只是根据动物细胞培养的特性，作适当的调整。要求搅拌器转动时产生的剪切力小，混合性能好，同时通气培养过程中尽量减小操作对细胞的损伤程度而又能达到充足供氧的目的。2、气升式生物反应器自1979年Katinger等首次用气升式生物反应器成功地进行了动物细胞的悬浮培养以来，气升式生物反应器在动物细胞大规模培养中的应用一直是生物工程学家关注和热衷的焦点。3、中空纤维生物反应器中空纤维生物反应器是个特制的圆筒，圆筒里面封装着数千根中空纤维。纤维是一种细微的管状结构，类似于动物组织内的毛细血管，中空纤维的外径一般为100－500um，管壁厚度约50－75um，管壁是极薄的半透膜，似海绵，富含毛细管。在中空纤维生物反应器中就形成了两个空间：一是“内室”，即纤维管内空间，可灌流无血清培养液供细胞生长；二是“外室”，即纤维管与管之间的间隙；细胞接种到外室，细胞贴附在外室的管壁上，并迅速吸取从内室渗透出来的养分，迅速生长繁殖。中空纤维反应器具有无剪切力和高传质等优点。中空纤维生物反应器的总体发展趋势是让细胞在管束外空间生长，以达到更高的培养细胞密度。中空纤维材质可以是纤维素、改性纤维素、醋酸纤维、聚丙烯、聚砜、铜氨人造纤维、聚甲基丙烯酸甲酯及其他聚合物。大规模HEK293细胞发酵培养

重组腺病毒的纯化

实时HPLC质量监测技术标准罐式搅拌反应器的改进细胞培养的搅拌动物细胞微载体培养技术1、细胞培养的搅拌普通叶轮水平剪切力很高，对动物细胞损害较大。海轮或倾斜叶片产生的混合剪切力，能产生水平和垂直混合速度，对动物细胞的损害比较小。一般培养过程搅拌转速控制在40－50rpm。2、动物细胞微载体培养技术直径在60-250um微粒，适用于贴壁细胞生长的微珠。微载体培养具有以下优点：①表面积/体积大，单位体积培养液的细胞产率高；②兼有悬浮培养和贴壁培养两种培养方式的优点；③可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面上生长情况；④培养基利用率高，劳动强度小；⑤细胞的收获过程简单。1）动物细胞在微载体表面的贴壁生长机制增殖经历：黏附、贴壁、生长和扩展成单层。

作用力：静电引力和范德华力。表面黏附取决于：细胞与微载体的接触几率、相融性。细胞与微载体的相融性与载体表面的物理化学性质有关。2）微载体的主要特性①微载体的大小微载体的颗粒直径应尽可能小，但微载体颗粒太小时，接种密度较高，就会对高密度细胞培养不利。通常微载体颗粒直径控制在100－200um之间。②微载体的密度搅拌转速40－50rpm时，一般在1.03－1.05g/cm3。③微载体的表面电荷

电荷的性质并不是控制细胞黏附和贴壁的决定因素，电荷密度才是关键问题，电荷密度太低，细胞贴附不充分；如果电荷密度太高，将会出现“毒性”作用而限制细胞的生长。3）微载体的种类①以交联葡聚糖为基质的微载体最广泛的一类微载体。主要有DEAE－交联葡聚糖、Cytodex2微载体、Dormacell微载体、Cytodex3微载体（迄今公认的最优秀的一种微载体）。②以塑料为基质的微载体主要有聚苯乙烯微载体、聚丙烯酰胺微载体等。③明胶/变性胶原微载体④以玻璃为基质的微载体⑤以纤维素为基质的微载体⑥液膜微载体⑦大孔微载体动物细胞的高密度培养一控制方法1、通气传统的细胞供氧方法会使一些动物细胞破坏，为了避免，通常采用顶部和表面通风，但通常会引起氧气的供应不足。表面积大的容器更有利于氧气的传递。工业上通常的做法是采用纯氧来代替空气，需要连接一个氧气放大器来进行控制。2、pH值常用的控制方法空气和二氧化碳分别由两根带阀的螺旋管喷射进入培养基，通过调节阀门来控制pH；用二次流量控制器将二氧化碳与空气相混合，然后再一起进入培养基，混入空气的二氧化碳总量由此来决定，从而使pH改变不明显；通过增加空气和减少二氧化碳的量可以降低培养基的pH。动物细胞培养的低搅拌速率和低混合度，易导致局部酸性或碱性过高的现象，可采用在液面以下滴加酸碱的方法解决。3、温度控制最有效的温控方法是通过在带夹套的容器中通入一定温度的水，水在一个装有