生物学考研经典复习题

基因组学

基因组学Genomics

•基因组(Genome：Gene+chromosome)细胞或生物体中一套完整的单倍体遗传物

质

•基因组学(Genomics)最早ThomasRoderick在1986年提出，包括基因组作图、测

序和分析。可分为结构基因组学和功能基因组学。

一、结构基因组学

1.遗传图(GeneticMappingGenomes):Basedonthecalculationofrecombinationfrequency

bylinkageanalysis.通过亲本的杂交，分析后代的基因间重组率，并用重组率来表示两个

基因之间距离的线形连锁图谱

每条染色体组成一个连锁群，所有染色体的连锁群组成的图谱即构成基因组遗传图。

重组率代表基因位点之间的相对距离。在遗传作图中，人们把一个作图单位定义为1厘摩

(cM),lcM等于1%的重组率。

提高遗传作图的分辨率:选用不同的杂交群体;增加杂交群体的数目；增加分子标记的数目；

扩大分子标记的来源

分子标记:绘制基因组遗传图需要的坐标点。

分子标记的主要来源是染色体上存在的大量等位基因。在DNA水平上，两个基因间一个碱

基的差异就足以形成等位基因。

2.物联L(physicalmap)：指DNA序列上两点的实际距离，它是以DNA的限制酶片段或

克隆的大片段的基因组UNA分子为基本单位，以连续的里叠群为基本框架，通过遗传

标记将重叠群或基因组DNA分子有序排列于染色体上。

物理图的绘制：BasedonmolecularhybridizationanalysisandPCRtechniques

杂交法；指纹法；荧光原位杂交技术。

3.基因组序列测定：Sequencingmethods:thechainterminationprocedure;

Map-basedclonebyclonestrategy;

Wholegenomeshotgun(WGS)strategy;

Sequenceassembly;

・传统基因组测序的方法：克隆步移法(BAC-bv-BACStrateRv)和全基因组鸟抢法(Whole

GenomeShotgunStrategy)<.

•基因组测序战略：基于物理图的克隆连克降法、随机挑选BAC克隆测序、逐步步

移法(LeeHood)、全基因组鸟枪法(CraigVenter)

4.基因组序列解析(AnnotatingGenomeSequence)：其目标是建立高密度的遗传图、高分

辨率的物理图和转录图，最终完成全基因组序列测定和注解，是功能基因组学的基础

基因组注解异常梵杂，它是一个繁杂的复合体，既包含了进化历史上原封未动的部分，

也有大量的进化史上重要历史事件的遗迹。

基因组有它自身的规律，但是一些“不和谐的韵律〃，如从病毒或者原核生物感染或寄生

得到的基因组片段、转座元件、假基因以及重兔序列的存在，构成了理解基因组结构的四大

陷阱。

AnnotatingaGenomeSequence

(1).Genepredictionbysoftware;

Genefiding:Findgenesancgenestructuresfromgenomicsequences

Problems

Findingtheparts:收集可靠的信息，并识别信号或传感卷作为整个基因的一部分。可能是

一些程序的端点，例如SplicePredictor.MZEF用于找寻外显子。

Puttingpartstogether:使用适当和有效的算法将部分组合在一起，产生完整的基因模型。许

多程序目前可用于全基因预测(GenScan,GeneMark.hrrm,Grail,Glimmer等)，这些程序

基于动态规划和基于HMM(隐马尔可夫算法)，将部分组合成整体。

Threetypesofinformation:

Signals(signalsensors):短子序列例如剪接位点，polyA信号和其他基序。信号传感器可以

表示为模式或权重矩阵。它们可以通过序列比对，统计方法或神经网络获得。.

Contentstatistics(contentsensors):描述了编码区的非随机性质，例如密码子偏好和反密码

子偏好性。

Similarity：与已知基因的相似性可有助于提高signalsensor和contenststatistics的准确性。

(2).Geneidentification:

expressedsequencetags(ESTs),

homologyanalysis,

mutations,

直系同源物：由共同的祖先基因进化而来的不同生物的同源基因

旁系同源物：一个物种中通过基因复制而演化形成的同源基因

(类似基因：非来自相同祖先的基因，但通过会聚进化而具有相似的功能特征的一个实

例是糜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的类似催化位点)

Howtomeasuresimilarity

Identity:Twoproteinsthathaveacertainnumberofamino-acidsincommonatalignedpositions

aresaidtobeidenticaltothatdegree,(i.e.iftheyhave43residuesoutofatotalof100in

commontheyare43%identical).

Similarity:Oftenanumberofresidueswillbereplacedbyonesofsimilarphysico-chemical

properties.Suchmutationsmaybetermedconservativeandonemaydefinevariousscoring

matricestoquantifyhowsimilarthetwosequencesare,takingintoaccountconservative

mutations.Suchscoreswillbemeasuresofsimilarity.

Homology:Ifandonlyif1\NOproteinsareevolutionarilyrelatedanddescendfromacommon

ancestor,theyarecalledhomologous.Similarityandhomologyaretwodifferentconceptsand

mustnotbeconfused.

comparativeanalysisbetweengenomes;

Pair-wisesequencealignmentisafoundationaloperationunitformuchofthebioinformatics

analysis

(3).Transcriptome&Proteome;

二、功能基因组学

1、定义：利用结构基因组提供的信息，在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生

物学研究从对单一基因或蛋白质研究转向对多个基因或蛋白质同时进行的系统研究，是在基

因组静态（碱基序列）清楚后转入对基因组动态（生物学功能）的研究。应用高通量的方法

来平行研究大量基因。

2、任务：进行基因组功能注释（Genomeannotation）,了解基因的功能，掌握基因的产物

及其在生命活动中的作用，从基因组的整体水平上来理解基因的功能与进化。

3、功能基因组研究内容：突变体库的构建、全长cDNA克隆与测序、获得DNA芯片等基因

转录图谱、高通量测序（NGS）转录组、植物全基因组关联分析（GWAS）

、高通量的遗传转化鉴定系统、生物信息技术平台与相应数据库的构建

（1）突变体库的构建

变异是功能分析的基础。突变体是功能基因组学研究的重要材料。

植物突变可在分子、细胞、组织、器官和个体等不同的水平上表现。一般分3种方法：

1.按突变方法分自然突变、物理化学诱变、DNA插入突变；

2.按遗传背景分为普通突变体库、近等基因系突变体库和等基因系突变体库：

3.按引起突变的分子机制分功能丧失突变和功能获得性突变

（2）基因克隆的一般方法

植物的生长发育是在多个代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现

象，分离潜在的各种有价值的基因，对植物特别是作物品种改良具有重要意义。

因此，对基因的克隆并发展与之相关的技术非常重要。

（3）高通量测序转录组技术

转录组测序亦称RNA-Seq（RNASequencing）,是指利用第二代高通量测序技术进行

CDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本

RNA-seq：双链均能被随机测序以致不能确定转录本方向

ssRNA-seq：通过消除双链中的反向链来特异识别转录本方向

ssRNA-seq：通过给5'末端脱磷酸->3'末端加adapter->5'复磷酸->5'加adapter来识别

转录本方向

NGS在转录组学研究中应用：转录组学：在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调

控规律的学科•，研究已知基因的SNP、Indel等，研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工

具，通常川于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技

术相结合的ChlP-Seq技术，能够高效地在全基因组范圉内检测与组蛋白、转录因子等互作

的DNA区段。测量基因表达水平，检测部分转录本的表达水平，发现新的基因和转录本，

检测发生在外显子部分的基因突变，发现基因融合等。综合mRNA-IncRNA共表达分析以及

microRNA靶基因分析，可以有效的解析IncRNA参与生物过程的分子机制

方法：功能克隆法，同源序列法，转座子或T-DNA标签法，表达序列标签法(EST)或全长

CDNA文库构建法，差异表达基因分离技术以及最新的高通量测序转录组

(4)基因的图位克隆

图位克隆(map-basedcloning)：又称定位克隆(positionalcloning),1986年由剑桥大学的

AlanCoulcon提出。

该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。在利用分了•标

记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA

文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因

最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱

基序列。

图位克隆的特点：无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有美信息。

但应有以下两方面的基本情况：

1.有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体，如F2、DH等。

2.开展以下几项工作：

找到与FI的基因紧密连锁的分子标记；

遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体；

构建含有大插入片断的基因组文库；

特定连锁探针筛选基因组文库；

用获得阳性克隆构建目的基因区域的重叠群；

通过染色体步行、登陆或跳跃获得带有目标基因的大片段克隆；

亚克隆小片段克隆；

通过遗传转化和功能互补验证目的基因的碱基序列。

(5)植物遗传转化技术的发展

定义：应用DNA重组技术，将外源基因通过生物、物理或化学手段导入植物基因组，以获

得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良体。

技术方法：

基因枪轰击法；

农杆菌介导法；

PEG转化法；

电激法(目前很少应用)；

低能离子束介导法(该技术不成熟)。

4、在植物功能基因组研究中发挥重要作用的技术：

植物转化(PlantTransformation)

增强子捕获(Enhancertrapping)

插入突变(TransposonT-DNAInsertion)

基因敲除(GeneKnockout)

基因沉默(GeneSilencing)

异位表达(EctopicExpression)

5、水稻基因组学

目标1：鉴定水稻基因组结构、变异和群体遗传学分析

目标2：基因组变异与表型变异关联(开发基因组学研究的新方法，系统鉴定和挖掘水稻品

种的遗传多样性，开展高效的水稻功能基因组研究)

目标3：阐明水稻的驯化和遗传育种改良史

具体研究工作：

1、水稻4号染色体精细测序、水稻高通量转录组分析和高通量基因型鉴定

2、建立水稻重要农艺性状的全基因组关联分析研究体系和分析方法

3、运用基因组学研究手段开展水稻驯化起源和相关性状基因的克隆和功能研究

4、其它植物基因组相关研窕

水稻全基因组关联分析分析框架

最后一张ppt老师留的思考题：

1、什么叫基因组学？

基因组学最早由ThomasRoderick在1986年提出，足研究生物基因组和如何利用基因的一

门学问，包括基因组作图、测序和分析工可分为结构基因组学和功能基因组学，该学科提供

基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。

2、基因组的研究内容？

基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural

genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functionalgenomics),又被称为后基

因组(postgenome)研究，成为系统生物学的重要方法。

功能基因组学的研究内容：人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、模

式生物体的研究和生物信息学的研究等。

结构基因组学：其目标是建立高密度的遗传图、高分辨率的物理图和转录图，最终完成全基

因组序列测定和注解，是功能基因组学的基础。

3、基因组学有哪些研究手段和方法？

通过建立高密度的遗传图、高分辨率的物理图和转录图，最终完成全基因组序列测定和注解

(包括DNA层次、蛋白质层次和代谢调控过程层次)。测序技术有：全基因组鸟抢法、基于

物理图的克隆连克隆法、生物芯片技术、第二代测序技术(454高通量测序、IlluminaSolexa

测序技术、Solid测序技术)、第三代测序技术(单分子测序)

4、水稻基因组学研究的主要进展？

开发基于测序的基因分型技术及对重组群体的遗传分析

建立水稻重要农艺性状的全基因组关联分析研究体系和分析方法

水稻单倍体图谱构建&品质、产量和抗性等复杂性状关联分析

水稻开花期等重要农艺性状的关联分析及候选基因的精确定位

水稻基因鉴定和功能研究

文献概括：

目标1：鉴定水稻基因组结构、变异和群体遗传学分析

目标2：基因组变异与表型变异关联（开发基因组学研究的新方法，系统鉴定和挖掘水稻品

种的遗传多样性，开展高效的水稻功能基因组研究）

目标3：阐明水稻的驯化和遗传育种改良史

具体研究工作：

⑴水稻4号染色体精细物理图的构建及水稻基因组精确测序；

⑵通过比较基因组和功能基因组，发现了一系列在水稻抗热，抗旱和抗盐生理过程中起重要

作用的基因；

⑶以第二代测序仪为基础的高通软功能基因组研究平台为大规模发现和利用水稻遗传资源

开辟了有效的新途径：

⑷利用基因组学和群体遗传学的方法来揭示水稻驯化过程和栽培稻的起源。

3.周金秋chromosome>chromatinandtelomeres

ChromosomeandChromatin

染色体和染色质的功能:

1.储存基因信息

2.把复制的DNA精确复制到两个后代染色体中

3.转录，复制，重组和修复的平台

如何从染色体中获得遗传信息？

染色质的两种形式：常染色质&异染色质

染色质活性态沉默态结构域形成与维持，几乎涉及所有组成分子：

1.DNA序列：异染色质区含大量重复序列板块；常染色质顺式元件对相邻异染

色质沉默高度敏感

2.组蛋白和非组蛋白：组蛋白变体；组蛋白尾区各种修饰位点；非组蛋白

3.RNA:ncRNA

常染色质：易脆；活跃；在核内

异染色质：染色深；折叠致密；基因不活跃；在核边缘

Constitutive异染色质：固定的不可逆的异染包质（例如着丝粒和端粒）

兼性异染色质：能够变成常染色质（例如不活跃的X染色体）

染色体组成：DNA、组蛋白、非组蛋白、RNA和脂质

染色质的基本重复单位nucleosome

核小体定位（nucleosomepositioning）核心组蛋白DNA特异序列经相互识

别与诱导契合，确定八聚体在DNA超螺旋中的结合部位以及两者空间结构关系。

核小体定位影响因素：1.偏好：基因上游启动子区；2.DNA构象；3.八聚体藏性

氨基酸正电荷侧链与DNA负电荷磷酸基静电引力；4.非组蛋白，核酸酶，转录

调节因子的影响；5.八聚体各亚基间和组蛋白DNA间界面中，水分子和离子的

影响。

核小体由5种组蛋白构成：H2A,H2B,H3,H4作为核心组蛋白，H1起连接作用；

核小体提供了核内最低等级的DNA压缩方式；核小体通常伴随转录

染色质的高级结构染色质组装

DNA(2nM)——核小体(10nm)——螺旋管solenoid(30nm)——染色质样纤维

chromoncmafibcr(60-100nm)loop玫瑰花结rosette染色质有丝分

裂时压缩为染色体

注：

1.组蛋白尾区和接头H1,是压缩阵列形成与稳定的必需要素

2.染色体结构维持蛋勺(SMCproteins)是一组高度保守的染色体ATPases,在

染色体组装及动态变化中发挥着基本作用：

三种核酸内切酶敏感位点指示染色质高转录活性

DNaseI,DNaseII,微球菌核酸酶

表观遗传标志：

核定位，DNA甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA

各表观遗传机制共同调节基因的表达或沉默：

1.DNA甲基化：DNAmethyltransferase

去甲基化:两种途径：Tet酶orBERpathway

DNA甲基化DNA去甲基化

CpGIsland:aclusterofCpGresiduesoftenfoundneargenepromoters;〜60%ofall

genesarcassociatedwithCpGislands;MostCpGislandsarcunmcthylatcdinnormal

cells;Itsmethylationisassociatedwithcancer（在基因启动子附近经常发现一组CpG

残留物;60%的基因与CpG岛有关;大多数CpG岛在正常细胞中没有甲基化花的

甲基化与癌症有关）

2.组蛋白尾修饰

3.沉默染色质个和异染色质类似的概念

■基因沉默：genesilencingactsinaregionalmanner（ratherthanpromoter-or

sequence-specific%。generatelargedomainsorDNAthatareusuallyinaccessibleto

DNAbindingproteins（RNApolymerase,cellularrecombinationmachinary,

exogenousenzymes（dammethykransferaseandrestrictionendonuclease）（基因沉

默行为在一个地区的方式（而不是启动子或sequence-specific）生成大域或DNA

通常无法进入DNA结合蛋白（RNA聚合酶、细胞重组机械，外源性酶（大坝甲

基转移酶和限制性内切核酸酶））

•Silentchromatindomain:Ttispersistentthroughmitoticandmcioticcelldivisions

suchthataparticularchromatinstructure（DNAanditsassociatedproteins）is

replicatedduringtheprocessofchromosomeduplication.Thismodeofinheritance,

commonlyreferredtoasepigeneticinheritance,isbelievedtounderliecellular

memor\Tmechanismsthatmaintaincellidentityandstablepatternsofgene

expressionineukaryotes.（沉默染色质域:在染色体复制过程中，通过有丝分裂

和减数分裂的细胞分裂，使一种特殊的染色质结构（DNA及其相关蛋白）复制。

这种遗传模式，通常被称为表观遗传，被认为是细胞记忆机制的基础，这种

机制在其核生物中维持细胞的身份和稳定的基因表达模式。）

•序列特征：重复DNA序列以及可能于稳定这样的结构有关。

•沉默染色质异染色质的生化特征：H3K9甲基化的普遍性；赖氨酸残基的低

乙酰化；DNA胞啥咤甲基化

•常染色质和异染色质的比较（染色、形态特征，序列，基因密度，减数分裂

重组频率，复制时期，HSsite,核小体分布，核酸酶可接进性，活性状态，

特征性修饰）

II.Centromere着丝粒

着丝粒：

着丝粒是存在于真核生物染色体上，动粒装配的区域；

是有丝分裂过程中，纺锤体发出的纺锤丝附着于染色体的部位；

是细胞分裂过程中，姐妹染色单体相互黏着的部位；

是保证经复制的染色体精确分配的一段染色质区滋。

着丝粒的结构：

・1个着丝粒，结构复合体，动粒-纺锤丝，一系列着丝粒特异相关蛋白(CENP)

•着丝粒序列：在多数真核生物中，着丝粒没有明确的序列；典型的着丝粒由

大片范围的重复DNA序列构成，这些重复序列相似却不完全相同。

•酵母着丝粒相对简单；人类着丝粒：高度重复的、随机排布的卫星DNA,

长达300-5000kb

动粒Kinetochore

动粒是是真核细胞染色体中位于着丝粒两侧的两层盘状特化结构，其化学本质

为蛋白质，是非染色体性质物质附加物。

动粒与染色体的移动有关。在细胞分裂的前、中、后期等几个阶段，纺锤体的

纺锤丝(或星射线)需附着在染色体的动粒上，牵引染色体移动、将染色体拉向

细胞两极。

III.ChromosomeTerritory染色体领域

解释了染色质纤维缠绕成染色体时为何不会相互打结，andmoresignificance

Concept:Thenaturalhabitatofeukaryoticgenomesisthecellnucleus,whereeach

chromosomeisconfinedtoadiscreteregion,referredtoasachromosometerritory.

定位FISHanalysisofchromosome(greenorredorblue).荧光原位杂交技术。

TotalDNAisstainedwithDAPI(blue)

Highlights:

1.Eachchromosomeoccupiesadistinctnuclearsubvolumeintheformofa

chromosometerritory.染色体领域。

2.Thespatialpositioningofchromosomeswithintheinterphasenucleusisoften

nonrandom.染色体的空间定位通常是非随机的。

3.Chromosomesexhibittissue-specificorganization.Chromosomesaredistributed

tissuc-spccifically(relativetothecenterofthenucleusandalsorelativetoeach

other)血织特异性°

4.Subsetsofchromosomesformdistincttypesofspatialclustersindifferenttissues

andtherelativedistancebetweenchromosomepairsvariesamongtissues.空诃簇。

5.Nonrandomspatialproximityisfunctionallyrelevant(genesilenceactivation,

translocationin).非随机空间邻近性在功能上是相关的(基因沉默激活，转

位）。

现存问题及未来方向：

到目前为止，这个领域的大部分工作都是描述性和相关的。

确定核空间内单个基因、基因组区域和全染色体重新定位的分子机制。

确定这些机制如何反应，并通过信号通路促进生理信号，如刺激。

充分理解一维DNA序列是如何引起基因转录网络的多维复杂性的，它决定了

生命的所有方面。

IV.Telomere

1、端粒和端粒酶

•概述：端粒是存在于真核生物线性染色体末端的特化的功能复合体，是由重

复的DNA序列及端粒相关蛋白构成，对于维持真核基因组完整性和稳定性至

关重要。（端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。）

・功能：1.防止DNA修复系统错误地将染色体末端识别为染色体断口而将染色

体粘接起来；2.促进末端染色体的复制；3.抑制端粒附近的基因转录。

即是保持线性染色体的稳定，即不环化、不粘合、不被降解。

•端粒结构（1着丝粒、2亚端粒区域，3端粒重复区）。

哺乳动物端粒示意图：注意到哺乳动物端粒并不是过去认为的线性结构，而

是形成DNA环（T环）

•端粒的延伸——端粒的

历史：最早提出了端粒延伸的两种可能途径：同源重组？酶？Grcidcr和

Blackburn证实了后者的正确性

人类端粒酶结构：hTERT（humantelomerasereverse

trancriptase）+h^R（humantelomerasetemplateRNA）

端粒延伸的机制：G链由端粒酶合成，hTR是端粒合成的模板：C链通过常

规的RNA引发DNA复制的方式进行合成。

注：应当注意到，端粒酶不是孤立作用的，它在染色体末端受到相关蛋白的

调节。以酵母为例：

2、端粒位置效应：TelomerePositionEffect（TPE）

•概述：端粒是基因调控的特殊位点，常可抑制位于端粒附近基因的转录

活性，这样的效应称端粒的位置效应。

•TPE涉及众多端粒结合蛋白的参与，如：酵母中的Sir234等

•端粒在细胞核中的定位亦受到一些蛋白的影响，如：yKu7080复合物和

Sir234特异影响端粒在分裂间期的核定位。

3、端粒和衰老

•几个易混淆的重要概念：

Aging（老化）：theprogressivelossoffunctionaccompaniedbydecreasing

fertilityandincreasemortalitywithadvancingage

Senescence（衰老）:thestateorprocessofaging

ReplicativeSenescence（Cellularsenescence）（复制细胞衰老）:astatethatcells

arrestaftertheyundergoalimitednumberofcelldivision

Lifespan（寿命）:atimeperiodcells（ororganism）canlive

•衰老表型（senescentphenotypes）:

1.不可逆的细胞分裂阻滞（DNA含量保持G1期状态，不能重新启动有丝

分裂）

2.对凋亡的抵抗（例如：人的成纤维细胞和T淋巴细胞）

3.细胞形态和代谢的改变，分化功能的重排（例如：细胞变大，溶酶体活

性增强，B-半乳糖甘酶表达）

•衰老表型的诱导因素：端粒缩短，抑癌基因的活性，DNA损伤，癌基因有

丝分裂刺激，染色质重构……

•不可逆生长捕获，细胞凋亡抵抗，改变分化的功能，其他……

•端粒和衰老的联系

培养正常的人类体细胞，在一定数量的分裂;50代）后，表现出有限的生命

期并进入衰老。

在人体细胞中，端粒缩短了5-20次，每个细胞分裂一次。

大多数体细胞都没有可检测的端粒酶活性。

端粒长度随着细胞的年龄而缩短，当端粒变得太短时，细胞最终死亡。

•端粒丢失的衰老学说（端粒长度一一有丝分裂钟）

在没有端粒酶的情况下，端粒会随着细胞分裂而缩短。当端粒达到极短的长

度时，正常细胞不可逆转地阻止增殖，并获得一个特征放大的形态和多种改变的

功能。这种反应被称为复制性或细胞衰老。

总结：端粒酶活性一一端粒稳态一一抑制染色质不稳定性一一延长寿命。

4、端粒和癌症

1.肿瘤是由突变引起的，它能激活致癌基因并关闭肿瘤抑制基因。

2.很少有显著的例外，没有多少人的肿瘤细胞会使它成为成熟的临床相关

肿瘤，而没有克服端粒依赖性的复制衰老。

3.在人类中，许多类型的癌细胞中检测到的端粒酶活性，在大多数体细胞

谱系中无法检测到。

4.端粒酶在绝大多数肿瘤中呈高表达(85%),但少数(10-15%)的端粒

酶阴性肿瘤仍能维持端粒的稳定长度。

5.这些少数的肿瘤细胞是通过端粒的替代延长途径(ALT)维持端粒长度

的。ALT的本质是同源重组。

同源重组：由一个端粒退火的DNA链与另一个端粒的互补链，从而利

用互补链作为复制模板启动新的端粒DNA的合成。

RAD52是一种蛋白质，在人类是由RAD52基因编码的。由该基因编码

的蛋白质与酵母菌(S.ccrcvisiacRad52)相似，它是DNA双链断裂修复和同

源重组的重要蛋白。可以结合单链DNA末端，并介导DNA与DNA的相互

作用，以使互补DNA链的退火。它也被发现与DNA重组蛋RAD51相互作

用，这表明它在与RAD51相关的DNA重组和修复中的作用。

•靶向端粒酶——肿瘤治疗的一个策略，包括靶向人端粒逆转录酶hTERT

和靶向端粒模板hTR(TelomeraseRNA)

a)催化(hTERT)组件

a)反转录酶抑制剂

b)hTERT启动子基因疗法

c)显性-阴性或shRNAhTERT基因治疗

d)小分子抑制剂

b)模板(hTERC)功能RNA组件

a)锤头核糖酶一一hTR模板

b)寡核甘酸一一端粒酶模板拮抗剂

展望：chromosome的未来研究趋

有机体应对端粒缩短策略

细小病毒：通过DNA

腺病毒:蛋白质启动

果蝇:逆转录转座

一些植物和昆虫：同源重组？

多数真核生物:端粒酶

未来的方向：

染色体隔离机制

染色体包装机制

端粒的信号机制

与染色体染色质生物学有关的疾病基因

治疗策略

补充材料

染色体

染色体是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染粒染成深色,所以叫染色体（染色质）;

其本质是脱氯核甘酸，是细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体，是

遗传物质基因的载体。

超微结构

染色体的超微结构显示染色体是由直径仅100埃的DNA-组蛋白高度螺旋化的纤维所组

成。每一条染色单体可看作一条双螺旋的DNA分子。有丝分裂间期时，DNA解螺旋而形成

无限伸展的细丝，此时不易为染料所着色，光镜下呈无定形物质，称之为染色质。有丝分裂

时DNA高度螺旋化而呈现特定的形态，此时易为碱性染料着色，称之为染色体。纤丝的结

构单位是核小体，它是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、

H3和H4）各两个分子构成的扁球状8聚体。现在我们知道，DNA分子具有典型的双蟒旋结

构，一个DNA分子就像是一条长长的双螺旋的纤丝。一条染色体有一个DNA分子。DNA双

螺旋依次在每个组蛋白8聚体分子的表面盘绕约1.75|卷，其长度相当于140个碱基对。组

蛋白8聚体与其表面上盘绕的DNA分子共同构成核小体。在相邻的两个核小体之间，有长

约50〜60个碱基对的DNA连接线。在相邻的连接线之间结合着一个第5种组蛋白（H1）的

分子。密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维，这就是染色体的“一级结构”，

就像成串的珠子一样，DNA为绳，组蛋白为珠，被称作染色体的“绳珠模型”如图一染色

体的“绳珠模型北

染色体复制时的形态

着丝粒的位置靠近染色体的一端时，根据着丝粒离开端部的远近，这着丝粒叫做近端部

着丝粒或端部着丝粒。着丝粒所在的地方往往表现为一个缢痕，所以着丝粒乂称初级缢痕,

有些染色体上除了初级缢痕以外，还有•个次级缢痕，连上•个叫做随体的远端染色体小段。

次级缢痕的位置也是固定的。在细胞分裂将结束时，核内出现一个到几个核仁，核仁总是出

现在次级缢痕的地方，所以次级缢痕也叫做核仁形成区。着丝粒的220对碱基序列两侧是限

制性内切核酸酶敏感位点，该位点的功能也许是促进DNA的断裂，有助于染色单体在后期

的相互分离。限制性内切核酸酶是一种在核酸内特殊位点进行切割的酶类。

着丝粒DNA序列

着丝粒DNA序列与染色体的分离有关。着丝粒DNA序列能确保染色体在细胞分裂时能

被平均分配到2个子细胞中去。着丝粒DNA序列特点：（1）一方面在所有的真核生物中它

们的功能是高度保守的，另一方面即使在亲缘关系非常相近的物种之间它们的序列也是多样

的。（2）绝大多数生物的着丝粒都是由高度重复的串联序列构成的，然而，在着丝粒的核心

区域，重更序列的删除，扩增以及突变发生的非常频繁，目前的种种研究表明，重复序列并

不是着丝粒活性所必须的，（3）有些科学家提出了可能是DNA的二级结构甚至是高级结构

是决定着丝粒位置和功能的因素，即功能的序列无关性。

端粒DNA序列

为一段短的正向重复序列，在人类为TTAGGG的高度重复序列。端粒DNA功能是保证

染色体的独立性和遗传稳定性。染色体的分裂有二种；一是母钟分裂，意思是按照母体蓝图

进行子代分裂，被分裂的23对染色体分别可以造出各种组织器官，如果第一条是造肝的，

那么它上面的所有造肝的基因片段都被打开，相反其它器官的制造信息都被关闭，这个过程

母体蓝图染色体要分裂4次；二是子钟分裂，按照母体蓝图分裂的23对人类染色体己经在

“母钟分裂”过程中分别被打开，它们各自按照各自的“子代蓝图”进行卜.面造器官的分裂，

一个个有机的器官从此被造出，并且开始发挥各自的功能，这个过程子体蓝图染色体要分裂

24次（个物种染色体的不同，其分裂的次数也不同，不过一个总的原则是按染色体数分裂），

在24次分裂后，一个完整的人体就被造出来；三是孙钟分裂，一个独立的人体，在生长发

育的过程中，还有一些器质性和功能性的东西没有出现，所以必须再打开，进行再分裂。比

如七岁儿童脱牙，十多岁少年具有生育能力，有些遗传病到一定时候的发作，等等。对应三

种分裂，必须有三种控制分裂发生的手段。母钟分裂是“端点（又叫端粒）控制体系”，这

种分裂的原始触发点在外界，比如飘荡在空气中的细菌，它只要没有接触食物或易感物，就

永远是不产生分裂的原命，一旦接触，在端点的作用下就开始母钟分裂。子钟分裂是受制于

子钟染色体的端点，与外界刺激无关。孙钟染色体分裂受制于染色体外相对应的一些蛋白质，

它们的功能仅仅是到一定时间将这个包含某信息的片段打开。依此看来，染色体就是人体的

生物钟。所以我们将第一条受精卵叫“母钟”，将母钟分裂出来的23对染色体叫子钟，将

23对染色体造出的各种组织器官所包含的染色体叫“孙钟”，改变子钟孙钟的染色体都不可

以改变遗传，只有改变母钟的基因才可以造成“变异”。染色体可以携带“遗传基因”但是

不能传递“打开信息”，打开某个基因段的所有信息都是通过染色体端点或染色体外的蛋白

质发挥作用才完成分裂或复制的。分裂是染色体整体的，复制是染色体某个基因片段的。

端粒

是染色体末端的DNA重复序列，作用是保持染色体的完整性。细胞分裂一次，由于DNA

复制时的方向必须从夕方向到3,方向，DNA每次复制端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，

染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。因此，端粒和细胞老化有明显的关系。一直

以来都知道精、卵细胞的端粒比成年体细胞的都长许多。

端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋

白一起构成了特殊的“帽子”结构，能够维持染色体的完整。

端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5,到3I方向的链富

含GT。在酵母和人中，端粒序歹lj分别为C1-3ATG1-3和TTAGGGCCCTAA,并有许多蛋白

与端粒DNA结合。端粒DNA主要功能有：第一，保护染色体不被核酸酶降解；第二，防止

染色体相互融合；第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完

全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是

基因调控的特殊位点，常可抑制位于端粒附近基因的转录活性(称为端粒的位置效应，TPE)。

在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的，另外，重组机制也介导端粒的延长。端

粒(telomere)是由许多成串短的重复序列所组成。该重复序列通常一条链上富含G(G-rich),

而其互补链上富含C(C-rich)。一个基因组内的所有端粒都是由相同的重复序列组成，但不

同物种的端粒的重复序列是不同的。

端粒除了含有重复DNA序列外，还包含有特殊的非核小体蛋白，即端粒结合蛋白“根

据该蛋白的结合特性分为两类，一类与端粒重复序列特异性结合，在维持端粒长度方面起到

重要作用，并且对端粒具有保护和调节作用；另一类与3,末端的单链突出结合，用于合成

染色体末端的帽子结构以及调节端粒酶活性。

端粒作用：染色体由于融合、降解、重排而形成不稳定结构从而威胁到DNA的正确复制和

细胞生存，端粒的存在能够保护染色体免于化学修饰、被核酸降解以及因端端作用而产生的

威胁。端粒使染色体末端区域形成异染色质，在细胞进行减数分裂的过程中结合到核膜-特

定区域，使得染色体寻找同源染色体启动和配对的过程更加容易，并且保证了染色体分离的

正确性。在细胞有丝分裂的过程中，端粒会随着分裂次数的增加逐渐缩短，当端粒缩短到一

定程度时便无法继续维持染色体的稳定，细胞最终死亡，故而能够根据端粒的长度预测细胞

的寿命。但是在生殖细胞中，端粒的长度不随细胞分裂而缩短，推测是由于生殖细胞中富含

端粒酶的缘故。

端粒酶

端粒颤是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于“逆转录酶'人类的端

粒酶亚单位基因已被复制出来,分别是端粒酶RNA(hTR)、端粒酶结合蛋白(hTPl)、端粒

酶活性催化单位(hTERT),它以自身的RNA作为端粒DNA复制的模版，合成出富含脱氧单

磷酸鸟昔(dGMP)的DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定「染色

体的结构。

端粒酶活性检测方法端粒重复序列扩增程序(TRAP)：苜先利用端粒酶活性延伸前导链

•o依据不同来源端粒酶的作用特性来设计前导链引物碱基序列；其次用于端粒重复序列互

补的反向引物通过PCR扩增端粒酶延伸产物。

端粒酶活性调控机制：端粒酶在不同细胞中对端粒的调控机制具有特异性。细胞自我更

新和增殖调控能够调节端粒解活性，如干细胞、肿瘤细胞等端粒陋活性一般高于体细胞，外

援信号也能够激活端粒酶活性使体细胞表现出癌细胞无限增殖的特性。对细胞周期中几个调

节点的调控很可能是决定瑞粒酶活性的潜在因素。

在肿瘤治疗中的应用：由于端粒酶在正常体细胞中几乎不表达而在肿瘤细胞中表达量较大，

故将其作为肿瘤治疗的靶点，直接抑制其活性或是从基因层面进行操作，来抑制癌细胞分

化，治疗癌症。研究表明，端粒能抑制剂比传统的癌症化学疗法和基因疗法有更高的特异性

和较少的副作用，并且有更广的应用范围，很可能对晚期扩散肿瘤也能起到抑制效果。

在癌症的诊断和预后评估中的应用：肿瘤诊断中，在早期肿瘤细胞中经常能够检测到端粒酶

活性的变异，在有转移倾向的癌细胞组织中更是能够检测到端粒酶的高表达，因而对于癌症

的早期诊断有着重要意义。同时了解端粒酶的结构功能及其活性调控因素也有助于提高对于

肿瘤发生机制的认识，提供治疗癌症的新思路。

端粒、端粒酸与细胞寿命

细胞衰老是细胞生命活动的必然规律，hayflick等指出：细胞，至少是培养的细胞，不

是不死的，而是有•定的寿命的：它们的增殖能力不是无限的，而是有•定的极限。这就是

著名的“Hayflick极限二Hayflick等还发现，细胞的增殖能力与供体的年龄有关。如从胎儿

肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而从成人肺得到的成纤维细胞只能传代20

次，提示这可能与成人细抱的端粒长度小于胎儿细胞的端粒长度有关。

说明染色体末端重复序列TITFAGGG(端粒)在细胞衰老过程中特异地依赖DNA复制而

丢失。相反，精子中的端粒长度与受试者的年龄无关。这是因为精子中有端粒酶的表达，使

端粒保持恒定长度的缘故，所以，端粒的长度被认为是人体细胞寿命的标志。

理论上说，细胞的寿命决定于端粒的长度和端粒DNA在体内的消减速度。但有资料表

明，有一些动物有较长的瑞粒而寿命不长，如老鼠的端粒长达50Kbp〜150Kbp，而人只有

15Kbp,但人比老鼠寿命长得多。在酵母细胞中也发现，酵母细胞分裂24代之后会死亡，

但老年细胞没有发现端粒的明显缩短。所以端粒对细胞寿命的影响有多大尚难定论。

PAPER

讨论课paper相关内容(1989)：

作者通过筛选端粒变短而表现出的特有性状来筛选出与端粒酶的酵母突变体，最后发现

一种突变体的端粒急剧缩短，并且表现出染色体缺失频率升高的表型，这种突变体揭示了一

种新的基因/「577(「orevershortertelomeres),一直变短的端粒。康77的无义等位基因并

不表现立即死亡，而是表现出一种衰老的症状，正是由于缩短的序列影响了端粒酶的功能，

导致染色体不稳定性增加，细胞也不断死亡。突变体的另一个表型足，在高温下生长受到

抑制，这个能够促使新陈代谢其他方面的改变，可能导致细胞的死亡。他们猜想，端粒影响

染色体的稳定性是从影响了核酸前体的水平，从而导致了多种表型的发生。

这篇paper证实了前人所做的猜想，端粒酶能影响染色的稳定性，最终导致细胞的凋

亡。Paper还提出一种假设，端粒的变短能够影响细胞的代谢发生变化，从而也导致其凋亡。

端粒是染色体末端的DNA重复序列，它保证了DNA复制的完成和染色体的完整性。研

究表明在植物和动物的端粒都是由简单相似的重复序列组成的。但是在这篇文章之前还没有

找到端粒酶，不知道它的作用机制。这篇文章的出发点是如果和端粒复制相关的酶发生突变,

则不会导致立即的死亡而是缓慢的死亡或衰老。

流程:

用到的主要技术：

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶

电泳分离经限制性内切醯消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段

转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记

探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：

具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交

过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核

酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态，如是否有点突变、扩增重排等。

人工染色体：(artificialchromosome)指人工构建的含有天然染色体基本功能单位

的载体系统。包括酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、P1派生人工染色

体(PAC)、哺乳动物人工染色体(MAC)和人类游离人工染色体(HAEC)。人工染色体为

基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。如：YAC是有酵

母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。

端粒酶的作用机制

4.陈勇老师蛋白质科学

ProteinScience陈勇

第一节概述

一、蛋白质的结构组成

一级结构：氨基酸序列；

二级结构：a螺旋、310螺旋、兀螺旋、*折叠、*转角，超二级结构是由两个以上二级

结构组成的motif：

三级结构：指由一级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距较远肽段之间的儿

何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系；

四级结构：蛋白质分子或复合物的多亚基结构和分子聚合体。

二、蛋白质特点总结：

蛋白质是由氨基酸按照特定序列连接通而成的生物大分子；具有一定的分子质晟和电荷,

复杂的分子结构和生物学功能。

蛋白质的生化特性分析方法：

1组成：酸水解，6MHCI,105℃,18h,打断所有的肽健，HPLC分析；序列分析：Edman

降解，MASS

蛋白酶水解，将蛋白水解为多肽，用质谱进行分析

2质量：绝对质量：沉降分析，静态光散射分析

相对质量：SDS,凝胶过滤

蛋白浓度测定:Nitrogencontent(16%)Kjeldahltest凯氏定氮法

Regularlyusedmethods:

UVabsorptionat280nm(aromaticresidues:W&Y);205-22Cnm(peptidebond)

Dyebinding(Bradford)

Bis-cinchonicacid(BCA)reagent

Lowry-Folin-Ciocaleaureagent

Biuret-alkalinecopperreagent碱性铜试剂双缩腺法

3电荷：等电点测定：等点聚焦法；

2D电泳法：一维先利用等点聚焦法分离(等电点分离)，二维采用SDSpage分离(质量)

4结构：

蛋白质的稳定性：

Thermalshiftassay蛋白质热转移技术

差示扫描量热法(DSC)

差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry,DSC),一种热分析法。在程序控制

温度下，测量输入到试样和参比物的功率差(如以热的形式)与温度的关系。差示扫描量热

仪记录到的曲线称DSC曲线，它以样品吸热或放热的速率，即热流率dH出(单位亳焦秒)

为纵坐标，以温度T或时间t为横坐标，可以测定多种热力学和动力学参数，例如比热容、

反应热、转变热、相图、反应速率、结晶速率、高聚物结晶度、样品纯度等。

蛋白质二级结构：

circulardichroism(CD),圆二色

用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱,是研究稀溶液中蛋白质构象的一种

快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方汰

快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之并已广泛

应用于蛋白质的构象研究中。

结构解析研究：

MaintechniquesinStructuralBiology

,X-raymacromolecularcrystallography

,Solutionnuclearmagneticresonance(NMR)

•Electroncryomicroscopy(Cryo-EM)

•Theoreticalmodeling

•Others:smallangleX-rayscattering,electrondiffraction,massspectrometryetc.

5功能：

蛋白质修饰：乙酰化、泛素化、甲基化、磷酸化

利用质谱分析探测蛋白质修饰

第二节蛋白纯化与相互作用研究

一、蛋白纯化

1Differentsolubilities

盐析:盐或有机分子可逆沉淀。大多数蛋白质在高盐浓度下溶解性较差，这种效应称为盐析。

蛋白质沉淀的盐浓度因蛋白质而异。因此，盐析可用于分离蛋白质。透析可以用来去除盐。

最常用，便宜，溶解度高，不会导致蛋白变性

(NH4)2SO4：

2Differentsizes

©Differentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification

©Dialysis-Separationbasedonsize通常用于将蛋白与小分子分离

③SizeExclusion(gel-filtration)chromatography分子排阻色谱,主要根据凝胶孔隙的孔径大

小，高分子样品分子的线由尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法，大分子先出

峰，小分子后出峰

@SDS

3Differentcharges

Ion-ExchangeChromatography-SeparationBasedonCharge

以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相

带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离•子基团进行可逆变换。

根据组分离子对树脂亲介力不同而得到分离。进而用递增的盐浓度梯度竞争性洗脱分离的目

的蛋白。

4Differentligandbindings

Affinitychromatography亲和色谱

将一-对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基(也称为配体)，与具有大孔径、亲

水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用血亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被

分离物质的混合物随着流