《白肋烟烟碱转化株鉴定规程》研究报告

YC/T《白肋烟烟碱转化株鉴定规程》研究报告 “白肋烟烟碱转化株鉴定规程”项目来源于国家烟草专卖局文件国烟科〔2013〕115号《国家烟草专卖局关于印发2013年度烟草行业标准制修订项目计划的通知》。该项目牵头单位为国家烟草栽培生理生化研究基地，协作单位包括中国烟草白肋烟试验站、四川省烟草公司、云南省烟草公司大理州公司和云南省烟草农业研究院。该项目任务下达后，按照合同约定，制定了项目实施方案。各承担单位积极开展了研究工作。国家烟草栽培生理生化研究基地初步起草了白肋烟烟碱转化株鉴定标准，并与四川省烟草公司和云南省烟草公司大理州公司联合进行标准的试验和验证，通过在大田设置田间试验比较不同鉴别标准对降低后代群体烟碱转化株和烟草特有亚硝胺含量的效果，取得预期结果，证实了该标准的科学性和有效性。中国烟草白肋烟试验站和云南省烟草农业研究院也采用该标准对所选育的白肋烟品种进行验证，取得了较好的应用效果。现将主要研究结果报告如下：一、白肋烟烟碱转化株的鉴定时期由于转化株的烟碱转化主要发生在烟叶的调制期，因此要对转化株进行早期鉴定，必须首先对转化性状进行诱导。鉴定时期需在开花前完成，以便选择单株进行杂交授粉或自交留种。研究表明，乙烯利或碳酸氢钠水溶液处理可以有效激活转化株的烟碱去甲基酶活性，使烟碱转化达到基因型所规定的程度。对转化株的鉴定从苗期到开花前都可以进行，苗期鉴定的好处在于可以提前在移栽前将转化株去除，避免其进入大田，但由于苗期鉴定叶片小，样品量少，加大了分析测定的难度，因而以移栽后4-6周取样测定为好，便于大批量处理和检测。在国内系统研究了烟草生长发育不同时期烟叶对乙烯利处理的反应。烟草从育苗到移栽再到现蕾开花要经历漫长的生长发育过程，为了明确不同生育阶段烟株的烟叶对乙烯利诱导处理的反应，在温室条件下分别种植不同转化类型烟株的的后代烟苗，于不同时期取样进行烟碱转化的诱导，结果表明，不同生育时期进行烟碱转化诱导可以取得较为一致的定性结果，高转化株在5个时期测定所得到的烟碱转化率均在90%以上，低转化株的烟碱转化率在30%到43%之间，而非转化株各时期测定烟碱转化率均在3%以下（图1）。同时，我们注意到在苗期取样进行转化株诱导可以得到较高的烟碱转化率，但由于苗期叶片小，生物碱测定难度较大。由于转化株的烟碱转化主要发生在烟叶的调制期，因此要对转化株进行早期鉴定，必须首先对转化性状进行诱导。研究表明，乙烯利处理可以有效激活转化株的烟碱去甲基酶活性，使烟碱转化达到基因型所规定的程度。对转化株的鉴定从苗期到开花前都可以进行，苗期鉴定的好处在于可以提前在移栽前将转化株去除，避免其进入大田，但由于苗期鉴定叶片小，样品量少，加大了分析测定的难度，因而以移栽后4-6周取样测定为好，便于大批量处理和检测。高转化株低转化株非转化株Highconverterlowconverternon-converter图1不同时期取样进行转化株诱导的效果二、烟株取样部位研究表明，烟株不同部位的叶片都可以用来进行转化性状诱导，但下部叶发育时间长，诱导所需时间短，效率高，宜用下部叶进行诱导和检测。为了明确不同叶位的烟叶对乙烯利处理诱导烟碱转化的反应，我们以高转化株为材料，在移栽后第7周同时对所有部位的烟叶取样，双数叶片在乙烯利处理后保湿晾制，单数叶片喷清水后保湿晾制，10d后测定烟碱转化率。结果如图2所示，虽然不同叶位的叶片生理年龄和发育程度存在很大差异，但在乙烯利处理后均可以使烟碱转化得到充分的诱导，基本达到基因型所规定的最大烟碱转化程度，各部位叶片的烟碱转化率都达到95%以上，这表明任何部位的烟叶，即使是未充分发育的叶片也可使用乙烯利处理的方法进行烟碱转化的诱导和转化株的鉴别。但考虑到烟碱转化是与烟叶的衰老过程相伴随的，下部叶片发育时间较长，诱导所需时间较短，对烟叶产量影响小，所以以选用下部叶为宜。结果还表明，未经乙烯利处理的自然晾制叶片在不同部位间存在显著的烟碱转化程度差异，随着叶位的升高，在自然晾制条件下的烟叶的烟碱转化率呈明显的下降趋势，这主要与不同部位叶片的成熟度有关。图2乙烯利处理对转化株不同部位叶片烟碱转化诱导的影响三、转化性状的诱导方法和技术（一）大田生长条件下乙烯处理对转化株早期鉴定效果首先利用乙烯利处理方法对大田生长的烟株进行烟碱转化诱导和转化株的早期鉴定。于移栽后3周对大田烟株进行挂牌定株，每株摘取1片烟叶用浓度为0.3%乙烯利水溶液均匀喷洒，使叶片充分湿润，然后在保湿条件下进行晾制，在叶片完全变黄后烘干磨碎，测定样品的烟碱、降烟碱含量，计算烟碱转化率。在烟株成熟后，在同一烟株上摘取相邻1片烟叶进行自然晾制，晾制结束后烘干粉碎，测定生物碱含量并计算烟碱转化率。图3表示了白肋烟开花前进行乙烯利处理对烟碱转化的诱导和转化株的鉴定效果。多数烟株为非转化株，其烟碱转化率较低，而且乙烯利处理烟叶和自然晾制烟叶的烟碱转化率没有显著差异。但同时采用乙烯利处理方法鉴别出一些低转化株，这些转化株在正常的自然晾制后烟碱转化率并没有显著升高，因此如果不进行乙烯处理诱导很难被鉴别出来。对于转化程度较高的转化株，乙烯利处理后，烟碱转化率显著高于未经乙烯利处理的烟叶，一般比自然晾制的烟叶高出2-3倍。图3乙烯利处理对大田生长烟株烟碱转化的诱导和鉴别效果进一步分析表明，根据自然晾制后烟叶烟碱转化率的测定结果并不能有效和完全鉴别群体中的转化株，一些转化程度较低的低转化株由于烟碱转化不完全，烟碱转化率没有显著升高，因此往往被划定为非转化株而保留。采用乙烯利处理可以使转化株的烟碱转化性状得以充分表达，从而鉴别出一些在常规晾制方法中无法鉴别出来的低转化株，因而实现转化株的更有效的鉴别。以我国白肋烟TN90为材料，研究了乙烯利处理进行转化株早期鉴定结果与调制后烟叶烟碱转化率的一致性。在移栽后30d选60棵正常烟株挂牌定株，摘取1片下部叶，用乙烯利水溶液均匀喷洒，保湿晾制7d后，进行烟碱和降烟碱含量测定，计算烟碱转化率。在烟株成熟后，按常规方法进行半整株晾制，38d后采样进行第二次烟碱和降烟碱含量测定，计算烟碱转化率。对60棵烟株用乙烯利处理方法进行转化株的诱导鉴定，结果发现23株烟叶的烟碱转化率达到5%以上，为烟碱转化株，占总测定株数的38.3%，其中10株的烟碱转化率超过20%，为高转化株，占总测定株数的16.7%。在烟叶成熟后，按正常方式进行半整株晾制，干叶期对田间定株的烟株进行第二次取样，测定烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率。结果表明，在所测烟株群体中有18株烟叶的烟碱转化率达到5%以上。图4为两次测定结果的比较，从中可以看出，通过乙烯利处理早期鉴定的转化株包括了所有18株在调制后自然形成的转化株，而且两次测定所得的烟碱转化率的株间分布趋势具有较高的一致性，说明通过诱导方法早期鉴定转化株是十分有效的。结果还表明，早期转化株的诱导后所得到的烟碱转化率一般高于烟叶自然晾制后的烟碱转化率，进一步说明乙烯利处理可以刺激和促进具有烟碱去甲基能力烟株的烟碱向降烟碱转化，这对提高转化株鉴定的准确性和有效性十分有利。更有意义的是，采用乙烯利处理方法进行诱导，可以鉴别出一些在正常晾制条件下无法有效鉴别的低转化株。本试验中，有5个低转化株只在早期诱导条件下才被鉴别出来，因此，通过乙烯利处理可以有效地鉴别低转化株，从而提高鉴定的效果。图4乙烯利早期诱导后与调制后烟叶烟碱转化率的比较目前我国栽培上应用的白肋烟品种主要有两类，一是利用雄性胞质不育系配制的杂交种，如鄂烟1号、鄂烟3号、达白1号等，另一类为系统选育的常规品种，如TN90、TN86等，它们普遍存在烟碱转化株比例较高的问题，因此对其进行改良是当务之急。对于杂交种的改良，主要是对亲本材料进行转化株的早期鉴定，并严格选择非转化株进行杂交制种；对于常规品种的改良，主要是在早期鉴定的基础上去除转化株，留取非转化株进行种子生产。本试验表明，乙烯利处理进行转化株的早期鉴定对品种的改良效果非常明显，非转化株的自交后代群体中，非转化株的比例达到91.4%，而未改良的品种群体非转化株的比例仅为60%。由于在非转化株的自交后代中仍会出现少量的低转化株，这些转化株会在以后的世代中积累扩散，因此，转化株的鉴别和品种的改良应成为一项经常性的工作。（二）碳酸氢钠对离体叶片烟碱转化的诱导作用以温室栽培的白肋烟TN90转化株和非转化株作为试验材料。分别在移栽后1周的烟苗及移栽后4周的烟株上摘取叶片进行试验，每株取相邻叶片2片，其中幼株取自上而下第4和第5片，成株为自下而上第4和第5片，每株所取的2片叶其中1片用碳酸氢钠水溶液喷洒处理，另1片叶仅喷洒清水作为对照。碳酸氢钠的浓度幼株叶片为0.8%，成株叶片为1%。喷后叶片在温度为33℃，湿度为80%的恒温恒湿箱中保湿晾制6天，之后烘干磨碎，测定叶片生物碱含量和烟碱转化率，测定结果见表1。从结果可以看出，对于非转化株，在碳酸氢钠处理后6天，叶片烟碱转化率与对照叶片没有显著差异，但对于转化株，碳酸氢钠处理的叶片烟碱转化率比对照叶片一般高出2-3倍，表明碳酸氢钠对转化株的烟碱转化有明显的促进和诱导作用。值得注意的是高转化株在经碳酸氢钠处理6天后，烟碱转化率达到93%表1NaHCO3处理对不同类型烟叶烟碱转化率的影响NaHCO3处理对照材料类型烟碱（%）降烟碱（%）烟碱转化率(%)烟碱（%）降烟碱(%)烟碱转化率（%）幼株非转化株0.3690.0122.85（0.42）0.4280.0112.49（0.39）低转化株0.2590.15036.67（5.82）0.3540.0328.28（3.25）高转化株0.0180.32594.75（4.09）0.2470.11832.42（5.23）成株非转化株1.1320.0211.85（0.32）1.0890.0221.99（0.41）低转化株0.8010.42934.88（5.24）0.8850.18016.92（3.56）高转化株0.0410.59693.56（5.59）0.5230.39943.29（6.18）以上数据为10-15株烟的平均值，括号内的数据为标准差（三）碳酸氢钠浓度对烟碱转化诱导效果的影响试验所用材料包括非转化株、低转化株和高转化株的幼株（移栽后1周）和成株（移栽后4周），目的是找出可达到最佳诱导效果的碳酸氢钠水溶液浓度。对于幼株的处理浓度分别为0(H2Oonly),0.5%,0.8%和1.0%，对于成株采用的处理浓度分别为0(H2Oonly),0.5%,1.0%和1.5%，烟株第4和第5片叶摘掉后进行处理，在恒温恒湿箱中晾制。结果表明，不同碳酸氢钠浓度对烟碱转化的诱导效果有显著影响。对成株来说，最适宜的处理浓度为1%，在此浓度下，所得到的烟碱转化率最高，且达到最大转化率的处理时间也最短。图5表示了不同处理浓度对烟碱转化的诱导作用，经1%浓度碳酸氢钠水溶液处理的烟叶在处理后4天进行测定，烟碱转化率已达到95%。浓度较低时，会造成烟碱转化不完全，而且需要较长的时间进行晾制以达到一定的转化程度。浓度过高时，会造成叶组织伤害，进而抑制烟碱转化过程的进行。碳酸氢钠处理后对烟碱转化的诱导和促进作用伴随着叶片衰老过程的加快，烟碱转化达到最大时，在叶片外观上一般表现为完全变黄，并开始变褐。幼株叶片相对较为柔嫩，因此对碳酸氢钠处理更为敏感，最佳的处理浓度为0.8%，浓度过高时，叶片坏死斑增多，造成烟碱去甲基活动终止，烟碱转化进行不完全，烟碱转化率降低（图6）。图5碳酸氢钠不同浓度处理对成株烟叶烟碱转化的诱导效果图6碳酸氢钠不同浓度处理对幼株烟叶烟碱转化的诱导效果（四）环境温度对碳酸氢钠诱导效果的影响碳酸氢钠处理后烟叶晾制的环境温度对能否取得最佳的烟碱转化诱导效果至关重要。烟碱转化是一种酶促反应，酶的活性高低受温度的直接影响。为了探索温度对烟碱转化的影响，摘取具有相同叶龄的35片转化株叶片，分成5组，在经1%浓度的碳酸氢钠水溶液处理后，分别在设置不同温度的恒温箱中晾制。结果表明，在37C环境中晾制3天，转化株的烟碱转化率达到了最大值，随着环境温度降低，在晾制后相同时间内烟叶烟碱转化率降低，达到相同烟碱转化率所需的晾制时间延长(图7)。在23C条件下，晾制3天后烟叶的烟碱转化率只有32%，晾制9天后，烟碱转化率仍然低于90%。温度超过37C同样对烟碱转化的诱导不利，在40C条件下，死青斑在叶片上出现，在43维持适宜的相对湿度同样非常重要，在一定的湿度条件下可避免叶片失水过快，以保证烟碱去甲基酶保持正常活性。根据实验观察，为保证烟碱转化充分进行，叶片经碳酸氢钠处理后晾制环境的相对湿度要保持在75%以上。图7不同晾制温度下碳酸氢钠处理叶片的烟碱转化率（五）无机盐处理对大田转化株烟碱转化的诱导和鉴别将未经纯化的白肋烟TN90在大田种植，移栽后1个月定株100株。其中50株用1.2%碳酸氢钠处理进行转化株早期鉴定，另外50株用1.2%氯化钠进行早期鉴定。结果分别发现18株和21株烟叶的烟碱转化率达到5%以上（图8和图9）。在烟叶成熟后，按正常方式进行半整株晾制，干叶期对田间定株的烟株进行第二次取样，测定烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率。结果表明，在所测2个烟株群体中分别有12和16株烟叶的烟碱转化率达到5%以上。从两次测定结果的比较可以看出，通过碳酸氢钠和氯化钠处理早期鉴定的转化株包括了所有在调制后自然形成的转化株，而且两次测定所得的烟碱转化率的株间分布趋势具有较高的一致性，说明通过诱导方法早期鉴定转化株是十分有效的。结果还表明，早期转化株的诱导后所得到的烟碱转化率一般高于烟叶自然晾制后的烟碱转化率，进一步说明碳酸氢钾和氯化钠处理可以诱导和促进具有烟碱去甲基能力烟株的烟碱向降烟碱转化，这对提高转化株鉴定的准确性和有效性十分有利。更有意义的是，采用碳酸氢钾和氯化钠处理方法进行诱导，可以鉴别出一些在正常晾制条件下无法有效鉴别的低转化株。本试验中，两个群体中分别有7个和5个低转化株只在早期诱导条件下才被鉴别出来，因此，通过碳酸氢钾和氯化钠处理可以有效地鉴别低转化株，从而提高鉴定的效果。图8碳酸氢钾早期诱导后与调制后烟叶烟碱转化率的比较图9氯化钠早期诱导后与调制后烟叶烟碱转化率的比较碳酸氢钠可有效诱导转化株鲜叶烟碱转化，被用来鉴别早期生长烟株群体中得转化株和非转化株，从而对转化株进行清除，这在烟草育种或制种过程中非常重要，因为转化株需要在烟株开花前得以确认，以避免将转化株留种或作为杂交亲本。此外，碳酸氢钠是环境友好型的化学药剂，并在食品加工和生产中广发应用，因此具有较高的安全性。碳酸氢钠诱导转化株烟碱转化的效果受一些因素的显著影响，碳酸氢钠的浓度和处理后的晾制温度对于保证转化性状的充分表达十分重要，碳酸氢钠浓度偏低或晾制温度较低可导致烟碱转化不完全，进而降低烟碱转化率，并会延长烟碱转化性状的表达时间；碳酸氢钠浓度过高或温度过高则会使叶片组织受害，抑制烟碱去甲基酶催化的烟碱转化过程的进行。烟株打顶前不同时期取样进行烟碱转化诱导具有相同的效果，但用未充分发育或成熟度较低的烟叶进行处理需要相对较长的时间才能达到最大程度的烟碱转化。四、样品生物碱测定和烟碱转化率计算。由于烟碱转化是烟碱在去甲基酶作用下转化为降烟碱的过程，可用烟碱转化率确定烟碱转化能力大小，即降烟碱占烟碱和降烟碱总和的百分比。烟碱转化率计算公式为：烟碱转化率（%）=降烟碱含量/(烟碱含量+降烟碱含量)×100五、确定烟碱转化株的标准研究表明，烟碱转化率2.5%为稳定好而可靠的烟碱转化株的下限指标，即烟碱转化率大于或等于2.5%的烟株为转化株，烟碱转化株低于2.5%的烟株为非转化株。（一）白肋烟不同程度烟碱转化株后代烟碱转化率株间变异转化株的鉴别标准是决定品种改良和纯化的关键，以往曾根据经验将烟碱转化率（降烟碱含量占烟碱和降烟碱含量之和的比例）大于5%定为转化株，后将此标准降低为3%，但一些烟碱转化率低于3%的烟株被证明具有转化株的性状表现，影响了品种改良的效果。前期研究表明，烟碱转化率高于2.5%作为转化株的鉴别标准具有更大的科学性，且烟碱转化株低于2.5%的烟株在不同叶位间和叶点间比较稳定，而烟碱转化率高于2.5%的烟株表现出叶位间和叶点间的较大变异。为了进一步确定新的烟碱转化株鉴别标准的可靠性和有效性，于2009年和2010年采用转化株早期诱导鉴别方法研究了不同程度转化株自交后代株系烟碱转化率的株间变异和分布，由于低转化株烟碱转化基因为杂合，后代会出现株间分离，本研究以期根据自交后代的分离情况对转化株和非转化株进行科学判断，为今后白肋烟亲本选择和品种改良提供依据。试验于2009年在四川达州市烟科所大田生长条件下，材料为达所26，为白肋烟杂交种达白1号和达白2号共同的父本，共种植200株，移栽后30天定株编号，每株取中部1片烟叶进行转化株的诱导鉴定，计算每株的烟碱转化率，选择具有不同烟碱转化能力的具有代表性的烟株套袋自交，所获种子于2010年在四川达州市烟科所按株系进行种植，在移栽后30天对每个株系不同烟株进行烟碱转化诱导，测定烟碱转化率的株间分布。在对达所26转化株早期鉴定的基础上，共选择不同程度烟碱转化能力的烟株分别套袋自交制种，得到18份株系种子于2010年在四川省达州市烟科所种植，每个小区40株，在团棵期每个株系随机取20株分别进行烟碱转化化学诱导和生物碱的测定。母代PNC<2.5烟株自交后代烟碱转化率的株间变异和分布：母代烟株达所26-3、达所26-14、达所26-84和达所26-99的烟碱转化率均在2.5%以下，其自交后代群体烟碱转化率的株间分布如图10。四个株系烟碱转化率分布较为一致，均不超过2.0%，变异幅度分别为0.345%~0.918%、0.474%~1.322%、0.344%~1.603%、0.258%~1.967%，变异系数较小，分别为30.32%、32.07%、35.84%、56.06%，性状稳定，烟碱转化能力较低。图10母代PNC<2.5烟株自交后代烟碱转化率的株间分布母代2.5<PNC<3烟株自交后代烟碱转化率的株间变异和分布：母代烟株达所26-30、达所26-65和达所26-66烟碱转化率分别为2.964%、2.890%和2.556%，介于2.5%和3%之间，自交后代烟碱转化率的分布如图11。三个株系的烟碱转化率变异幅度分别为0.439%~10.331%、0.466%~21.834%和0.394%~3.757%，变异系数分别为94.59%、185.34%和64.49%。烟碱转化性状分离明显，表明烟碱转化率在2.5%~3%之间的烟株性状不稳定，是转化株的表现，后代群体中可分离出不同程度的烟碱转化株。图11母代2.5<PNC<3烟株自交后代烟碱转化率的株间分布母代3<PNC<20烟株自交后代烟碱转化率的株间变异和分布：所选择的7个自交烟株的烟碱转化率3%和20%之间，其自交后代烟碱转化率的株间分布如图12。烟碱转化率变异范围很大，分别为0.751%~61.427%、0.423%~16.072%、0.774%~9.419%、0.384%~31.886%、0.205%~21.494%、0.393%~23.514%和0.714%~23.375%，变异系数分别为161.73%、142.08%、77.54%、106.43%、118.11%、157.99%和94.54%，株间变异较大，表明烟碱转化性状分离明显，群体中出现较高比例的转化株。图12母代3<PNC<20烟株自交后代烟碱转化率的株间分布母代20<PNC<50烟株自交后代烟碱转化率的株间变异和分布：选择的达所26-67和达所26-109烟碱转化率分别为20.418%和24.352%，在20%~50%范围内。2个株系自交后代烟碱转化率的株间分布如图13，其烟碱转化率变幅分别为0.738%~30.438%和0.611%~41.813%，变异系数较大，分别为79.16%和93.84%，株间变异也较大。图13母代20<PNC<50烟株自交后代烟碱转化率的株间分布母代PNC>50烟株自交后代烟碱转化率的株间变异和分布：达所26-23和达所26-104自交后代烟碱转化率的株间分布见图14。其烟碱转化率分布较为整齐一致，烟碱转化率变异幅度分别为50.607%~88.989%和37.916%~68.659%，变异系数分别为19.05%和14.57%，变异性最小，可以稳定遗传和表达。图14母代PNC>50烟株自交后代烟碱转化率的株间分布由下表得出，母代PNC<2.5烟株自交后代烟碱转化率全部小于2.5%，转化程度较低，烟碱转化率较为稳定，在减少后代群体烟碱转化能力方面取得了显著的改良效果，制种过程中对其进行选择的压力较小。母代2.5<PNC<3的达所26-30、达所26-65和达所26-65烟株自交后代分别出现烟碱转化性状分离现象。由此可知，如果把转化株的鉴别标准定在2.5%，将有利于提高鉴别的有效性。母代3<PNC<20的7个烟株自交后代中烟碱转化率在3%~20%区间的烟株相对较多。20<PNC<50的亲本自交后代中烟碱转化问题较突出，烟碱转化率大于3%的烟株占75%以上。母代烟株PNC>50的达所26-23自交后代烟碱转化率大于50%的烟株占100%，达所26-104的占70%，具有较强的烟碱转化能力。这进一步说明了严格进行亲本选择对于后代种群纯化和改良的重要性。表2自交后代不同株系烟碱转化率分组分析母本自交后代分组株号烟碱转化率/%PNC<2.5比例/%2.5<PNC<3比例/%3<PNC<20比例/%20<PNC<50比例/%PNC>50比例/%平均烟碱转化率/%PNC<2.5达所26-31.97810000000.617达所26-141.69510000000.783达所26-842.39410000000.941达所26-991.52510000000.9352.5<PNC<3达所26-302.964551035002.828达所26-652.89075020502.528达所26-662.55690010001.3953<PNC<20达所26-810.317351545058.427达所26-163042达所26-224.16360040003.511达所26-2913.546405401509.083达所26-506.741451040505.262达所26-583.30660530503.249达所26-855.53830065505.42720<PNC<50达所26-6720.4182006515011.040达所26-10924.35215105025012.770PNC>50达所26-2389.964000010072.223达所26-10455.685000307053.662本研究从不同烟碱转化程度烟株自交后代的变异性和分离情况进一步确定烟碱转化率大于2.5%是确定转化株的有效标准，具有较高的可靠性。本研究中母代PNC<2.5烟株自交后代烟碱转化率均在2.5%以下，变异系数较小，性状稳定，是非转化株的表现。在品种改良中，严格选择PNC<2.5的烟株进行留种或配置杂交种可以最大限度地降低大田群体的转化株比例和烟碱转化率。母代2.5<PNC<3的烟株自交后代均出现株间烟碱转化性状分离现象，一些烟株烟碱转化率显著升高，是转化株的表现，因此，如果把转化株的鉴别标准定为3%，这些烟株将被视为非转化株被留种或用于配置杂交种，将显著降低品种的改良效果。母代3<PNC<50烟株自交后代烟碱转化率存在较大的变异性，株间变异也较大。母代PNC>50的2个株系自交后代多为高转化株，具有较强的烟碱转化能力。烟碱转化性状为显性基因控制，很容易在群体中积累，在白肋烟育种实践中，严格选择烟碱转化率小于2.5%的烟株进行留种或用作杂交亲本配置杂交种是必要的。（二）基于不同烟碱转化株鉴别标准的白肋烟品种改良效果白肋烟群体中转化株的比例和转化程度直接影响白肋烟的香味品质和安全性。所以从群体中去除转化株是降低烟叶和产品中TSNAs含量及提高和改善烟叶香味品质的有效途径。近期研究表明，烟碱转化率高于2.5%作为转化株的鉴别标准具有更大的科学性，且烟碱转化率低于2.5%的烟株在不同叶位间和叶点间比较稳定，而烟碱转化率高于2.5%的烟株表现出叶位间和叶点间的较大变异，而且自交后代仍会出现烟碱转化性状的分离。本研究基于不同的烟碱转化株鉴别标准对云南白肋烟主栽品种TN86进行遗传改良，旨在明确不同转化株鉴别标准的科学性和对改善烟叶品质和降低TSNA含量的效果，为白肋烟品质育种和品种改良提供依据。1、不同改良种和株系早期诱导后烟碱转化率株间分布：TN86改良种1（PNC<2.5）烟碱转化率的株间分布：TN86改良种1（PNC<2.5）烟株烟碱转化率的株间分布如图15，其烟碱转化率变异幅度为1.00%-9.43%，变异系数为49.58%，烟碱转化性状分离不明显，表明烟碱转化率在小于2.5%之间的烟株性状稳定，仅有少量低转化株出现。图15TN86改良种1（PNC＜2.5）烟株烟碱转化率的株间分布TN86改良种2（PNC<3）烟株自交后代烟碱转化率的株间变异和分布：TN86改良种2（PNC<3）的烟株自交后代烟碱转化率的株间分布如图16，其烟碱转化率变异幅度为1.52%-16.07%，变异系数为91.93%，烟碱转化性状分离突出，表明烟碱转化率低于3%的烟株群体中存在转化株。图16TN86改良种2（PNC<3）烟株烟碱转化率的株间分布TN86改良种3（PNC<5）烟株自交后代烟碱转化率的株间分布：TN86改良种3（PNC<5）的烟株自交后代中烟碱转化率的株间分布如图17，其烟碱转化率变异幅度为1.702%-45.931%，变异系数为128.18%，变异系数较高，性状分离明显，表明群体中含有一定数量的转化株，后代群体中可分离出不同程度的转化株。图17TN86改良种（PNC<5）烟株烟碱转化率的株间分布转化株系1（5<PNC<20）烟株烟碱转化率的株间分布：为了验证转化株的分离规律，研究中选择了转化株进行对比试验。高转化株系1（5<PNC<20）的烟株自交后代烟碱转化率的株间分布如图18，其烟碱转化率变异幅度为1.73%-57.41%，变异系数为118.88%，烟碱转化性状分离相对明显，且不同程度转化株呈连续分布，其中包含一定数量的高转化株。图18高转化株系1（5<PNC<20）烟株自交后代烟碱转化率的株间分布高转化株系2（PNC>20）烟株自交后代烟碱转化率的株间分布：高转化株系2（PNC>20）烟株自交后代烟碱转化率的株间分布如图19，其烟碱转化率变异幅度为3.93%-89.84%，变异系数为43.92%，变异系数较低，烟碱转化性状分离不明显，表明烟碱转化率在PNC>20之间的烟株性状较稳定，后代烟株均为转化株。图19高转化株系2（PNC>20）烟株自交后代烟碱转化率的株间分布2、TN86不同改良种和株系转化株和非转化株比例由表3可以得出，TN86改良种1（PNC<2.5)群体中非转化株比例为80%，低转化株比例为20%，没有出现高转化株，平均烟碱转化率为2.07%（小于2.5%），说明改良种1（PNC<2.5)非转化株比例较高，烟株的性状稳定。TN86改良种2（PNC<3)和TN86改良种3（PNC<5)种植的后代中非转化株比例显著降低，群体中出现大量低转化株，说明这2个改良种烟碱转化性状较不稳定，后代分离出现转化株的比例较高。高转化株系1（5<PNC<20)非转化株比例占15%，平均烟碱转化率为12.65%。TN86高转化株系2（PNC>20)在种植的后代中全为转化株，且大部分为高转化株，低转化株的比例仅占10%，平均烟碱转化率62.67%。表3白肋烟不同改良种和株系的转化株鉴定结果分组非转化株比例/%低转化株比例/%中转化株比例/%高转化株比例/%平均烟碱转化率/%TN86改良种1（PNC<2.5)8020002.07TN86改良种2（PNC<3)5545004.52TN86改良种3（PNC<5)25651008.35高转化株系1（5<PNC<20)157510012.65高转化株系2（PNC>20)010157562.673、调制后不同改良种和株系经济性状分析比较表4是TN86不同改良种和株系与TN86常规种经济性状的比较。从表中可以看出改良种1（PNC<2.5)的产量最高。改良种1（PNC<2.5)的产值较高，高转化株系2（PNC>20)的产值最低。TN86不同改良种和株系与TN86常规种的上等烟比例、中等烟比例以及均价之间差别较小。不同改良种和株系的中等烟比例表现为差异不显著。烟叶的产值和产量表现明显的差异显著性。从表3中可以看出，TN86改良种1（PNC<2.5)优于其他的改良种和株系。表4白肋烟不同改良种和株系与TN86和TN90经济性状的比较分析品种/株系产量kg•hm-2产值Yuan•hm-2上等烟比例%中等烟比例%均价Yuan•kg-1TN86改良种1（PNC<2.5)4750.6560428.2757.5624.8312.72TN86改良种2（PNC<3.0)4568.8457795.7657.4424.6712.65TN86改良种3（PNC<5.0)4540.9857579.5857.4024.6112.68高转化株系1（5<PNC<20)4438.34d51617.88d56.86b24.5111.63高转化株系2（PNC>20)4370.89de50658.6356.79b24.5011.59TN86常规种(CK)4662.24b58184.76b57.4824.7912.48b注：小写字母表示在0.05水平上显著，下同4、调制后不同改良种和株系的烟碱转化率分布图20和图21分别是TN86改良种和株系调制后上部叶和中部叶混合样品的烟碱转化率。结果表明，以PNC<2.5作为转化株的标准进行品种改良得到的改良种烟碱转化率最低，上部叶比常规种降低1.36个百分点，降低37.7%，中部叶比常规种降低1.37个百分点，降低38.3%。以PNC<3和PNC<5为转化株标准进行品种改良，所得到的的改良种烟碱转化率也较对照种相应降低，但降低的幅度相对较低。所选择的高转化株系的调制后烟叶烟碱转化率处于较高水平，且与转化株系的基础水平密切相关。图20白肋烟改良种和株系调制后上部叶烟碱转化率比较图21白肋烟改良种和株系调制后中部叶烟碱转化率比较5、不同改良种和株系调制后烟叶TSNAs含量比较对改良种和高转化株系后代调制后烟叶进行烟草特有亚硝胺含量的测定，结果表明，TN86常规种TSNA总量为3.001µg/g，以NNN含量最高，NAT含量其次（表5）。TN86改良种1（PNC<2.5)的总TSNA含量最低，比常规种降低17.9%,其次为TN86改良种2（PNC<3.0)。总TSNA含量的降低主要是由NNN含量的降低引起的，两个TN86改良种比常规