PH值荧光探针研究

[12]。香豆素类pH荧光探针是一类具有特定结构和荧光性质的化学探针，主要用于检测和分析溶液的pH值。它们通常具有紫外可激发的蓝色荧光特性，其荧光强度或波长随pH值的变化而发生变化，因此可以通过观察荧光信号的变化来推断溶液的pH值。香豆素类pH荧光探针在化学、生物和医学等领域具有广泛的应用。例如，在生物学研究中，它们可以用于实时监测细胞内或细胞外的pH变化。Liu等人在2013年开发了基于香豆素的含有苯并噻唑基团的近红外pH荧光探针5REF_Ref7839\r\h[13]，该探针在酸性条件下具有光学响应，能在pH为1.5-7.0的范围内进行监测，并且具有快速响应的能力。图8探针5响应pH的机理2018年，王鹏飞等人将香豆素酸乙酯引入到荧光素中，得到了香豆素与荧光素融合的荧光探针6（图9）REF_Ref7930\r\h[14]。该探针具有优良的光学性能，具有良好的细胞膜通透性和低毒性，能够快速监测活细胞中pH的变化。图9探针6结构与响应机理图在2020年，T.HienNguyen等人设计了具有咪唑基的新型科聚合香豆素类化合物REF_Ref8022\r\h[15]，乙烯基苄胺基咪唑甲基香豆素（VIC）、丙烯酰胺基咪唑甲基香豆素（AIC）和苯乙基咪唑甲基香豆素（SIC）(如图10所示)这些探针在碱性范围内对pH值由荧光响应，而随着pH的则更加，这些所有的香豆素类化合物的荧光强度均有明显降低，这些探针在pH范围为10.5-13.5由响应，因此可用于检测各种碱性介质中的pH值。图10探针VIC、AIC和SIC结构与响应机理图1.4论文的创新性本论文在pH荧光探针研究领域取得了比较创新的成果。首先，成功设计并合成了一种新型pH荧光探针HBD，该探针具有更高的灵敏度和更宽的pH响应范围，为细胞内和组织内pH值的精确测量提供了有力工具。此外，本论文深入探讨了荧光探针与pH值相互作用的机制，为荧光探针的设计和优化提供了理论支持。综上所述，本论文在荧光探针的设计、应用和作用机制等方面均取得了创新性进展，为相关领域的研究和发展有一定的贡献。2实验部分2.1目标分子的合成路线设计图11探针HBD-1的合成路线图2.2实验仪器和试剂表1实验试剂试剂名称试剂纯度出产公司乙酰丙酮分析纯（AR）上海阿拉丁生化科技股份有限公司4-叔丁基-2，6-二甲酰基苯酚分析纯（AR）萨恩化学技术（上海）有限公司氯仿分析纯（AR）西陇科学股份有限公司乙醇分析纯（AR）西陇科学股份有限公司哌啶分析纯（AR）广州化学试剂厂四氢呋喃分析纯（AR）广州化学试剂厂2-氨基苯酚分析纯（AR）上海阿拉丁生化科技股份有限公司2，3-二氯-5，6二氰-1，4-苯醌分析纯（AR）安徽泽升科技有限公司表SEQ表\*ARABIC2实验仪器仪器名称出产公司HitachiF-700型荧光光谱日本Hitachi公司Bruker-400型核磁共振波谱仪德国Bruker公司BrukeresquireHCT型质谱仪德国Bruker公司ZF-90型多功能紫外暗箱透射仪上海安瑞自动化仪器仪表有限公司81-2型恒温磁力搅拌器上海斯勒仪器有限公司SHZ-Ш型循环水式真空水泵巩义市峪华仪器厂AR1230型电子天平上海菁海仪器有限公司2.3目标产物的合成及表征4-叔丁基-2,6-二甲酰基苯酚（103mg，0.5mmol）和乙酰丙酮（100mg，1mmol）在哌啶和氯仿的条件下生成了产物HBD，浓缩溶剂后，产生黄色固体，之后将产物进行抽滤处理，得到大量含杂质的物质，再加入乙醇对产物进行洗涤，洗涤完后再用水进行再次洗涤、干燥，最后得到纯的产物HBD。HPD1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.80(d,J=20.6Hz,2H),7.61(s,1H),7.26(s,1H),7.17(s,1H),2.40(s,6H),2.22(s,3H),1.88(s,3H),1.24(s,9H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ210.43(s),202.12(s),201.63(s),154.66(s),148.47(s),147.62(s),139.57(s),139.37(s),133.62(s),125.86–125.68(m),125.41(d,J=48.4Hz),103.99(s),39.27(s),36.55(s),36.12(s),32.32(d,J=23.0Hz),31.71(s),31.71–31.50(m).将HBD的核磁管中加入适量的Na2CO3后隔绝空气，经1HNMR测试，此产物为HBD-1，因其活性太高，没有得到大量产物。1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.83(s,2H),7.33(s,2H),2.37(s,6H),2.09(s,6H),1.19(s,9H).图12产物HBD在阳光下（A）和荧光照射下（B）显现的颜色图片3结果与讨论3.1产物HBD结构分析论文中采用核磁共振质谱仪和质谱仪检测产物HBD的化学结构。图4-1为产物HBD的氢谱图，其中在1.24-2.40ppm处呈现出多重峰，7.17-7.61ppm处呈现出单峰，7.80ppm处呈现出双重峰，可发现有26个氢。由产物HBD的结构分析可知，这些氢分别来自苯环和碳链，且其氢峰已被明确确认。进一步计算表明，这26个氢的数量与产物HBD中氢原子总数相符。加碱后，在碱性条件下，HBD经历了开环变化，其氢的数量减少了一个，这一变化在附录中的图4-2中展示。此时，开环化合物中氢的数目下降到25个，表明开环变化已经成功发生。紧接着，对HBD的产物碳数进行分析，附录的图4-3呈现了其碳谱图。通过分析，发现该化合物中含有22个碳，这一结果与HBD产物中预期的碳数一致，有力地证明了该化合物的准确性。为进一步的研究，我们对HBD产物进行了质谱分析。离子峰分析计算的结果如附录中的图4-4所示，该化合物的相对分子质量为369.17。与理论预测值相比，此值基本一致，为HBD产物的准确性提供了进一步的证实。3.2产物聚集诱导发光性质为了验证探针HBD是否具有聚集诱导发光特性，我们研究了在不同含量PBS（pH=10）和四氢呋喃（THF）的混合溶液中HBD的荧光光谱性质。如图13所示，在THF含水量0%时，也就是在探针水溶液中，HBD发光微弱，在pH=10的缓冲溶液中逐渐增加THF时，溶液荧光强度逐渐增强；当溶液中THF含水量40%时，溶液体系中的荧光强度达到最强，后逐渐增加THF的含量，溶液体系的荧光强度不断地减弱。在pH=10的时候产物HBD中的螺环已经打开，此时水是良性溶剂而四氢呋喃THF是它的不良溶剂，众所周知，溶解度对分子运动的限制有显著影响，因此在THF含量增加的时候，分子内运动也受到限制，所以出现荧光强度随着THF含量增加而减弱的现象。因此，产物HBD是具有聚集诱导发光特性(AIE)的荧光探针。图13产物HBD溶液中THF不同含水量下荧光强度的变化3.3pH测试将少量固体产物HBD溶于四氢呋喃中，配成10mmol/L溶液，取10µL母液，分别加入10mLpH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PBS溶液。如图所示，pH为3.0-5.0的范围时，HBD在453nm处荧光强度随着pH的增大而增强；在pH为5.0-11.0的范围时，荧光强度随着pH的增大而逐渐减小。并且当pH=8时，在628nm处出现了一个新峰，且随着pH的增加，新峰的荧光强度逐渐增强。因此，探针HBD在碱性环境下，荧光性能较好。这是由于在酸性条件下，探针HBD的螺环处于“闭合”状态，发光波长较低，出现蓝色的荧光（图14）。随着pH的逐渐升高，氢氧根离子诱导螺环发生断裂，化合物由HBD变为HBD-1，出现628nm的发射峰，荧光颜色变为橙色。图14紫外激发下探针HBD的荧光光谱（pH3.0-11.0）图15紫外下HBD在pH=3.0和11.0的照片取波长的峰值453nm和628nm处地荧光强度绘制其与pH之间的关系曲线，如图16所示，在pH为3.0-5.0的范围内，453nm处的荧光强度迅速增强，而628nm处的荧光强度基本不变。当pH在5.0-11.0的范围内，453nm处的荧光强度迅速降低，而628nm处的荧光强度在不断增强，荧光颜色由浅绿色变为橙色，这是由于在碱性条件下，化合物HBD开环，形成HBD-1。值得注意的是，在pH约为9.5时，453nm与628nm处的荧光强度趋于一致。图16波长的峰值453nm和628nm处地荧光强度与pH之间的关系4结论通过一系列实验，我们验证了pH荧光探针在环境监测中的可行性和有效性。实验结果表明，HBD随着pH的增加，螺环打开，变为HBD-1，453nm处的荧光强度迅速降低，而628nm处的荧光强度在不断增强。同时，溶液由蓝色变为橙色，具有较高的灵敏度和准确性，能够实现对环境pH的快速、准确监测,为环境监测提供了一种新的、高效的工具。未来，我们可以进一步优化荧光探针的性能，拓展其应用范围，为环境保护和可持续发展做出更大的贡献。

参考文献霍永慧.pH和次氯酸荧光探针的设计及其生物应用研究[D].广西大学,2022.杨心怡.次氯酸荧光探针及在水样检测与生物成像的性能研究[D].辽宁科技大学,2022.胡娅琪,秦蓓,张博,等.卟啉金属有机框架材料在传感领域的应用[J].当代化工,2021,50(09):2225-2230.陈婉琪.水溶性卟啉光学探针在酸度测定和铜离子定量分析中的应用[D].厦门大学,2021.

王宇斌.新型Al~(3+)与pH荧光探针的合成及细胞成像研究[D].山西大学,2020.

陈彪.基于电子给体—受体构建纯有机室温磷光和荧光成像染料[D].中国科学技术大学,2018.H.Zhu,J.Fan,Q.Xu,H.Li,J.Wang,P.Gaoandх.Peng,Chem.Commun,2012,48,11766-11768.M.H.Lee,J.H.Han,J.H.Lee,N.Park,R.Kumar,с.KangandJ.s.Kim,Angew.Chem,Int.Ed,2013,52,6206-6209.ZhangXF,WangTR,CaoXQ,etal.Anear-infraredrhodamine-basedlysosomalpHprobeanditsapplicationinlysosomalpHriseduringheatshock[J].SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecularSpectroscopy,2020,227:117761.LiP,XiaoH,ChengY,etal.Anear-infrared-emittingfluorescentprobeformonitoringmitochondrialpH[J].ChemicalCommunications,2014,50(54):7184-7187.HouJR,JinD,ChenB,etal.Twonear-infraredhighlysensitivecyaninefluorescentprobesforpHmonitoring[J].ChineseChemLett,2017,28(8):1681—1687.姜舒.pH和HOCl荧光探针的研制及其在环境分析中的应用[D].江苏大学,2020.

LiuXD,XuY,SunR,etal.Acoumarin-indole-basednear-infraredratiometricpHprobeforintracellularfluorescenceimaging[J].Analyst,2013,138(21):6542-6550.QiS,LiQ,LiuW,etal.Coumarinfluorescein-fusedfluorescentdyesforrapidlymonitoringmitochondrialpHchangesinlivingcells[J].SpectrochimActaA,2018,204(5):590-597.NguyenTH,Su