DB21T 3095-2018 犬非结核细菌性肺炎诊断技术规范　　

DB21ThetechnicalSpecificationfordiagnosticbacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniaeforcanine辽宁省市场监督管理局发布I 1 1 1 13.2非结核细菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteria 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 本标准起草单位：锦州医科大学、鞍山动物检疫站、1犬非结核细菌性肺炎诊断技术规范本标准适用于我省动物诊疗单位及兽医工作者对犬非结核细菌性肺炎GB/T6682分析实验室用水规格和），），3.2非结核细菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteriapne包括结核分枝杆菌所致的肺结核。为了严格区分本标准将细菌性16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）等特征，所以，16SrRNA基因检测技术2依据流行病学特点、临床症状及影像学特征等作出初步诊断，确诊需做病原学4.1流行病学特点菌性肺炎流行的区域；发病率高，但致死率低，主要为4月龄以内的幼犬发病，成年犬少见发病；发病4.2临床症状诊断4.2.1呼吸系统症状4.2.2发热及相关症状4.2.3其它方面症状4.3影像学特征胸部X线检查显示肺纹理增粗，片状、斑片状、大片状阴影和实变影，可伴有支气管充气征、液气4.4外周血检查特征采集犬前肢头静脉（前臂头静脉）或后肢隐静脉或颈静脉血液样本1.0ml，采用血液分析仪或人工样检测，仪器自动分析、打印结果。人工计数方法取1滴外周血，滴于洁净无油脂的玻片制取血涂片，细菌性肺炎白细胞计数明显升高，其中中性粒细胞比例显著升高，并有核左移现4.5病原学检测4.5.1细菌分离培养和涂片镜检无菌操作采取气管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、脓液和血液，于血液肉汤培养基中37℃增菌10h后再划线接种于血液琼脂平板和胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基，37℃培养18～24h后观察有无菌落生长；4.5.2生化试验3挑取单个分离菌接种于细菌微量发酵管中，37℃培养18～24h，观察、记录生化反应结4.5.3致病性检验腹腔注射菌液0.25ml(2.1×108CFU/ml)菌液；另取5只体重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量灭菌脑心浸液。小鼠攻毒后连续7天观察临床表现及死亡情况。取发病死亡小鼠的肺、肝接种血液琼脂平板等4.5.4分子生物学鉴定27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCT按照通用型柱式基因组提取试剂盒说明书提取对PCR扩增产物进行回收和纯化，回收产物作为测序模板进行测序，测序要求对所测出的基因序列进行同源性比对分析，即登陆NCBI网站（htt注：M．DL2000DNAMarker;1.阳性对照；2-6.阳性扩增产物；N.阴45.1初步诊断根据流行病学特征和典型临床症状，结合外周血、X线影像学特征，可作出初步5.2确诊5细菌性肺炎主要致病菌分离鉴定具体方法和无菌操作采取气管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、脓液和血液，于血液肉汤培养基中37℃增菌10h后再划线接种于血液琼脂平板和脑心浸出液培养基，37℃培养18～24h后观察。在血液琼脂平板上应生长6V-P试验 + --+++-+--+ + ++ ++2.1应用16SrRNA基因序列分析法鉴定细菌，首先合成用于扩增细菌16SrRNA基因序列的通用引27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTC胶电泳检测，得到目的片段后，按照《琼脂糖凝胶胶回收试剂盒》（OMEGA）的说注：M．DL2000DNAMarker;1.阳性对照；2-6.阳性扩增产物；N.阴7肉汤纯培养物腹腔注射实验组小白鼠，每只注射0.2ml（4×108CFU/ml）对照组每只小白鼠腹腔注射0.2ml无菌肉汤。注射后小鼠隔离饲养，观察发病及死亡情况，并对死亡小鼠的心血、脑、肝脏、脾脏进行细菌分离鉴定。观察到试验组小鼠注射24h后应表现出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙竖起，呼吸急促、采食减少等现象；对照组小鼠无此现象。试验组小鼠72h后全部死亡。将死亡小鼠剖检，将脏器分G+球菌，圆形或卵圆形，直径约1μm，呈葡萄串状排列，无鞭毛、无芽孢、无荚膜。未见有色素沉着，菌落周围有明显的β-溶血环。菌落形态上形成1mm左右、凸起、黄色菌落，有金黄色色素产生，菌落周围的培养基由红色挑取可疑菌落转种于普通营养琼脂平板，37℃培养1将纯培养菌分别接种于H2S反应管和葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果8应用16SrRNA基因序列分析法鉴定细菌的通用引物、方法条件同链球菌；PCR产物测序与DNA序注：M．DM2000;1、3阳性样本；2.阳性对照（CQHC4CSA00）；浆的试管中，37℃培养，每0.5h观察1次，观察6h判定结果；同时用已知的血浆凝固酶阳性和阴性的取清洁级小鼠5只，分离菌株24h肉汤培养液（1.5×108CFU/ml经不同途径接种：下注射菌液1.0ml；1只小鼠腹腔注射菌液1.0ml；2只小鼠分别从静脉注射菌液0.5ml；1只小鼠由静脉注射灭菌生理盐水1ml作为空白对照。分别隔离观察，皮下注射菌液小鼠24h后注射部位皮肤应发生溃无菌操作采取气管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、脓液和血液，于血液肉汤培养基中37℃增菌10h后再划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板，37℃培养18～24h后观察。在胰蛋白胨大豆琼脂平板上生长出圆9应用16SrRNA基因序列分析法鉴定细菌的通用引物、方法条件同链球菌；PCR产因序列进行同源性比对。结果显示该菌株与序列(GenBank序列号：AP014582.1)同源性为96%以上，则将分离菌的纯培养物接种于脑心浸液中37℃培养18~24h，并计算活菌数。选取5只健康小鼠，腹腔注射菌液0.25ml（2.1×108CFU/ml）菌液；另取5只体重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量灭菌饮欲废绝，被毛杂乱等临床症状，在48h内全部死亡。对照组小鼠在观察期内，全部健康存活。死亡小例白细胞水平轻度升高；血清C反应蛋白（CRP）轻度升高；X线检查可见气管内影像增强，肺部影像肺部听诊和血常规检查无明显变化；血清C反应蛋白（CRP）水平轻度升高；X线检查可见气管内影像通过病原分离鉴定和分子生物学检测病毒核酸可区分其它本病由支原体（Mycoplasma）引起，潜伏期较长。患犬体况良好时，不表现明显的临床症状。发本病由衣原体（Chlamydia）引起，潜伏期较长。患犬体况良好时，不表现明显的临床症状。发病以凌晨时咳嗽最为重剧。经治疗后，咳嗽还可持续液，显微镜检查可见霉菌的菌丝。死亡患犬剖检可见肺脏上有大小不一的结节，结节周围有结缔组织犬瘟热是由犬瘟热病毒（Caninedistempervirus）引起的一种高度泌物，打喷嚏，有腹泻。在以后2～14天内再次出现体温升高，咳嗽，有脓性鼻涕。同时继发