肿瘤基因课件

肿瘤基因及其调控机制肿瘤基因第一节癌基因

一、癌基因的基本概念

逆转录病毒的研究对于阐明人类癌症的发生机理具有重要意义。逆转录病毒的基因组中除了病毒本身复制所必需的基因，如编码病毒核心蛋白（gag）、外壳糖蛋白（env）及逆转录酶（pol）等的基因外，还包括一个能引起细胞恶性转化的基因。这种基因就是现在为人们所熟知的癌基因（oncogene，onc）。肿瘤基因

由于最初是在病毒中发现的，所以称之为病毒癌基因（v-onc）。后来发现，在许多动物的正常细胞中都存在着与v-onc相对应的DNA序列，称之为原癌基因（proto－oncogene）或细胞癌基因（c-onc)肿瘤基因

现有资料表明：①细胞癌基因与病毒癌基因基本上是同源的，但用DNA测序技术可查明，在二者之间可以有一个或几个碱基对的差别。所以现在认为，细胞癌基因是病毒癌基因的前体，而病毒癌基因则是细胞癌基因的转导翻版；肿瘤基因

②细胞癌基因在长期进化过程中极为保守，在无脊椎动物（如果蝇）的基因组中就可以找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源的序列。所以实际上在正常情况下，细胞癌基因不仅对机体无害，而且可能在发育过程中，以至于对生命的维持起着重大的作用：肿瘤基因③细胞癌基因在正常细胞中可以有低水平的表达，而在癌组织中与其相对应的活化癌基因的表达水平却比它高的多。肿瘤基因二、癌基因的分类

较早期的分类是根据癌基因的产物在细胞内的定位，将其区分为胞质癌基因和核癌基因两大类。随着癌基因数量的增加，这一分类显得不够完善。近年来，人们趋向于用癌基因蛋白的结构与功能及其在细胞内的定位来进行分类。肿瘤基因

按照这一原则癌基因可分为五大类：

①生长因子类②酪氨酸激酶类③丝氨酸／苏氨酸激酶类④GTP结合蛋白（G蛋白）类⑤核结合蛋白类肿瘤基因Demezuk（1991）对癌基因作了全面的综述，列出了87种癌基因，并进行了分类。鉴于近年来又有一些新的癌基因和抑癌基因出现，对此作了一些增补。现以其资料为基础，对五举癌基因分别介绍如下：肿瘤基因1.生长因子类：属于这异类的有sis,int-2等五个癌基因。特点是其产物与某些生长因子极为相似：例如，猴肉瘤病毒v-sis癌基因的蛋白产物p28与血小板生长因子（PDGF）β链几乎完全相同。因此sis蛋白可模拟PDGF同其受体结合，刺激细胞过度增殖。肿瘤基因

受病毒感染的细胞可向周围分泌生长因子，后者又反过来向分泌它的细胞连续发放增殖信号，最终导致细胞癌变。这种癌变过程中的独特现象称为“自分泌”（autocrine)。小鼠乳腺瘤病毒（MMLV）的int-2癌基因产物gp27-34类似于成纤维细胞生长因子（FGF），其过度表达可诱发小鼠乳腺新月形癌。肿瘤基因2.酪氨酸激酶类：

属于这一类的癌基因较多，现在较明确的有21种。根据其功能的差别，还可分成两个亚类：

①细胞表面生长因子受体②膜结合的酪氨酸激酶肿瘤基因①细胞表面生长因子受体：包括erbB-l，erbB-2/HER/neu等7个癌基因。禽成红细胞瘤（AEV）病毒癌基因erbB-l的蛋白产物pl70与上皮细胞生长因子受体（EGFR）的氨基酸序列高度同源。因此，它可模拟EGFR进行工作。即使在没有外源性刺激时，也能不断地使胞内靶蛋白发生酪氨酸激酶反应，从而连续地向细胞核发放增殖信号，导致细胞过度增殖。肿瘤基因ErbB-2的蛋白产物pl85也与EGFR类似。猫肉瘤病毒癌基因fims的蛋白产物gp105～165

则与集落刺激因子（CSF-l）受体相似。肿瘤基因②膜结合的酪氨酸激酶：包括src-l，abl等14个癌基因。

Rous肉瘤病毒（RSV）癌基因src-l的蛋白产物pp60是第一个被人们分离，并研究得最多的癌蛋白，分子量为60kD，长526个氨基酸残基，分布在质膜内侧。pp60是专一地使蛋白质分于中的酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶，称为酪氨酸专一性蛋白激酶（用P-tyr表示）。肿瘤基因

在正常细胞中，P-tyr仅占总蛋白磷酸化的1／3000（其余由丝氨酸专一性蛋白激酶磷酸化，占90％，还有10％由苏氨酸专一性蛋白激酶磷酸化），而在被RSV转化的细胞中，P-tyr升高了10倍。本亚类中其他癌基因的产物也具有P-tyr活性。前述的erbB-l等生长因于受体均具有P-tyr活性，因而推测本亚类癌基因也可能参与细胞生长的调控。肿瘤基因

已知有一种含酪氨酸的粘着斑蛋白（vinculin）是pp60P-tyr蛋白激酶的底物之一。它位于质膜内侧的吸附斑中，而组成细胞骨架微丝结构的肌动蛋白束正好固定在吸附斑上。在正常细胞中，粘着斑蛋白的磷酸化仅占该蛋白磷酸化的1％，而在转化的细胞中则上升至20％。同时发现在RSV转化细胞株中吸附斑大量减少，其肌动蛋白束的结构遭到严重破坏。肿瘤基因Pp60P-tyr的另一种与细胞骨架有关的靶蛋白是p36，它结合在含有微管蛋白，肌动蛋白和肌球蛋白的细胞骨架上，它的酪氨酸被pp60P-tyr磷酸化后也可导致细胞骨架破坏。由此可见，RSV病毒转化的细胞中src癌基因的过度表达，是导致细胞骨架微丝、微管系统破坏的重要原因。肿瘤基因3.丝氨酸／苏氨酸激酶类：关于这类癌基因只列举了raf-1,mos和pim-1三种，它们的蛋白产物都是定位于胞质的丝氨酸／苏氨酸专一蛋白激酶，与第二信使CAMP调节系统有密切关系。已知有一种CAMP依赖性蛋白激酶就是丝氨酸专一性蛋白激酶，具有传递CAMP的信号及调节基因表达的作用。肿瘤基因

4.GTP结合蛋白类

此类包括ras族的H-ras，K-ras，N-ras三个癌基因，以及在垂体及卵巢肿瘤中发现的gsp癌基因。

ras族癌基因是目前研究得最多的癌基因。从人体肿瘤分离到的活化癌基因都属于ras族，其基因产物p21ras蛋白的分子量约21kD，长188~189个氨基酸残基，分布于质膜内侧。具有GTP依赖的GTPase活性，其一级结构和生化特性和“G蛋白”十分相似。肿瘤基因G蛋白是媒介多肽激素受体的信号与细胞内效应器腺苷环化酶之间的偶联因子，通过激活或抑制腺苷环化酶的活性直接或间接地调节cAMP的浓度，进而调控细胞的生长。

ras族原癌基因可能象G蛋白一样参加腺苷环化酶信号系统的调控。ras族癌基因在12，13或61位氨基酸残基的点突变将使p21ras失去水解的活性，并使细胞过度增殖。肿瘤基因

5.核蛋白类：属于这一举的癌基因有myc,myb,fos等12个。其中研究得最为详尽的是c-myc。c-myc最早发现于禽粒细胞瘤病毒（AMV）中，并广泛分布于从酵母到人的基因组中。它含有3个外显子，编码一种含439个氨基酸，分子量为62kD的蛋白质。该蛋白定位于细胞核内，属DNA结合蛋白，可同单链或双链DNA结合。肿瘤基因c-myc的表达具有组织专一性，细胞周期特异性和发育阶段特异性。在正常组织中c-myc可有低水平表达，而在大多数实体肿瘤中，其表达明显增高。在癌前病变和一些良性肿瘤中，也可见到表达增高。一般认为，c-myc的扩增是导致原癌基因活化的主要途径。肿瘤基因

以上资料表明，c-myc蛋白可能是一种调控细胞增值和分化的调控蛋白，它可以识别和结合到基因组中特定的识别序列，并活化那些与细胞增殖和分化有关的基因。

c-myb也有类似性质，主要在造血细胞分化的某些特定阶段表达，而在一些造血系统肿瘤中其表达可增高。肿瘤基因

近年来陆续发现了一些新的癌基因，它们在癌变过程中起着重要的作用：

①int-2②jun③met④PCNA

⑤Ki-67核抗原⑥

mdm2肿瘤基因①int-2

定位于7q31，编码分子量为27kD的蛋白，该蛋白的部分结构与成纤维细胞生长因子具有同源性。它具有刺激表皮细胞生长的作用，但需要与其他基因协同才能完成细胞的恶性转化。Int-2基因的扩增率在乳腺癌中达19％，但扩增的倍数不高。一般认为，该基因的高表达与肿瘤的转移，复发和预后不良有关。肿瘤基因②jun

定位于lp31～32，编码分子量39kD的蛋白。蛋白定位于核内。Jun与随后发现的junB，junD都是核转录因子，与c-fos形成转录调节复合物，其蛋白产物FOS／Jun能与其他反式因子如视甲醛受体（RAR）、糖皮质激素等相互竞争，对转录起调节作用。肿瘤基因③met定位于7p31，其转录产物有多种，分别为9.0,7.0,6.0,5.0和3.2kbmRNA。蛋白产物主要有两种，分别为ppl40-145met肝细胞生长因子受体和pp65tpr-met活化融合蛋白。最初确定其为转化基因是在以MNNG处理的人骨肉瘤细胞系中，由于l号染色体的tpr序列插入到7号染色体的met基因形成tpr-met重排而使其活化。肿瘤基因

其主要功能为促进肝细胞生长及诱发细胞转化。c-met基因的活化与多种肿瘤的发生有关，其活化机理主要为扩增和重排。现已证明，9.0kbc-metmRNA及其蛋白产物在胃癌和肝癌等肿瘤中的表达高出正常组织许多倍，而且表达程度与预后有关。肿瘤基因④PCNA增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）是一种在细胞增殖周期中合成和表达的36kD蛋白质，主要在G1后期及S早期在核仁中合成并在细胞核内聚集，因此进入细胞周期的正常细胞和肿瘤细胞都含有PCNA。采用PCNA单抗定位研究PCNA，可以作为判断细胞增殖情况和预后的一种手段。肿瘤基因⑤Ki-67核抗原

Ki-67存在于增殖细胞核内，在G1中期开始表达，S期和G2期增多，M期达到高峰，G0期细胞阴性，因此Ki-67在调节细胞增殖中起重要作用。用免疫组化法证明，癌组织中阳性细胞数明显高于正常细胞和良性肿瘤，因此对鉴别良恶性病变有一定实际意义。Ki-67表达水平的高低与肿瘤预后之间也有密切关系。肿瘤基因⑥mdm2

mdm2基因最初是从一个含有双微体（DM）的自发转化的BALB／3T3细胞系中克隆出来的一个高度扩增的基因，定位于12ql3～14上，该基因全长由2372个碱基对组成，编码区全长1473个碱基，编码一个长度为491个氨基酸践基的蛋白质，分子量为90kD。肿瘤基因

动物实验己证明，mdm2可使细胞转化并具有成瘤性。在某些恶性软组织肿瘤，骨和脑肿瘤中发现了mdm2扩增，说明其可能与这些肿瘤的发生有关。

mdm2癌基因不仅可通过扩增而直接致癌，而且可作用于抑癌基因p53使正常的p53失活而间接致癌。肿瘤基因三、癌基因的活化机理

细胞癌基因存在于正常细胞中，但在正常情况下并不表现出致癌性，只有在各种外因和内因作用下使细胞癌基因活化，才能导致肿瘤发生，癌基因活化的机理可能多种多样的，但主要的有以下6种：肿瘤基因1.转导（transduction）

2.点突变（pointmutation）

3.插入突变（insertionalmutation)4.易位(translocation)5．基因扩增（geneamplification）

6.基因甲基化的改变

肿瘤基因

1.转导（transduction）在漫长的生物进化过程中，现在的逆转录病毒的祖先在感染正常细胞的同时，通过复杂的遗传学重组和突变，将正常细胞的细胞癌基因整合到其基因组中，并使之改变成活化的病毒癌基因。带有病毒癌基因的逆转录病毒在感染适当的动物时，可使之发生肿瘤。肿瘤基因2.点突变（pointmutation）美国的Weinberg，Wigler和Cooper等实验室于1983

年分别从不同的膀胱癌细胞系中分离DNA，用以转染NIH／3T3细胞系，可使之发生恶性转化。从转化细胞中已分离到活化癌基因的分子克隆，并证明其与Harvey鼠肉瘤病毒的癌基因（v-Ha-ras）非常相似。肿瘤基因

在人类正常细胞中也发现了其对应物(c-Ha-ras),Barbacid与Weinberg的研究组分别发现，膀胱癌中的活化癌基因与其对应的正常癌基因之间只有一个碱基对的差别，即(c-Ha-ras)基因的第一个外显子(exon)所编码的多肽链氨基端第12位密码子上发生了有突变，其鸟瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其编码的甘氨酸被氨酸所取代。这一单个碱基对的点突变，看来就是正常细胞癌基因变成活化癌基因的关键。肿瘤基因3.插入突变（insertionalmutation)

逆转录病毒中的慢病毒本身不含有癌基因，但能以前病毒的形式插入到宿主细胞癌基因的邻近而将其激活。

肿瘤基因

在这方面最典型的例子是禽白血细胞增多症病毒（AW）。新生雏鸡在感染ALV后6～12月才产生肿瘤，在癌前期观察到法氏囊中大量细胞受到病毒感染，而且ALV的DNA插入到不同细胞基因组的不同位点。肿瘤基因

但是，在肿瘤细胞中前病毒DNA却存在于所有细胞基因组的同一位点，说明它们是由ALV的DNA插入基因组适当位点的一个细胞所形成的克隆。在肿瘤细胞中ALV的DNA可发生部分缺失，但至少项保存一部分。肿瘤基因Hayward等进一步证明，在大多数肿瘤中ALV前病毒插入到细胞癌基因的5`端，并处于相同的转录方向。ALV前病毒的长末端序列（LTR）经常缺失或失活，所以可能其3`端LTR为转录提供强有力的启动子，从而产生大量与前病毒DNA相连的c-myc序列。肿瘤基因

在有些情况下，前病毒虽插入到c-myc的5`端，但处于相反的转录方向，或插入到的3`端而处于相同的转录方向。这两种情况也可加强c－mvc的转录，但其作用机理尚不太清楚。肿瘤基因

同时CooPer等发现，从这类肿瘤中提取的DNA可转化NIH／3T3细胞，但奇怪的是，从中分离到的转化基因既不是ALV的DNA，也不是活化的c-myc，而是位于另一位点的片段，称之为Blym，它编码一个分子量约为7kD的多肽。由此可见，在诱发的肿瘤中至少涉及两个癌基因的活化。肿瘤基因4.易位(translocation)

在人类巴基特淋巴瘤的细胞系中，发现第8号染色体长臂远端片段易位至第2，22和14号染色体的一定部位。肿瘤基因

现有资料证明，这些部位分别含有免疫球蛋白轻链Igκ,Igλ和以及重链IgH基因。由于这些部位经常进行着活跃的转录，可以提供强有力的启动子，而易位的第8号染色体片段已证明含有细胞癌基因c-myc,可以被相邻的启动子活化。肿瘤基因

还有资料指出．易位的c-myc的3`端与免疫球蛋白基因的3`端相连。这一情况类似于上述ALV前病毒的插入，即c-myc插入到启动子的下游，但处于相反的转录方向。肿瘤基因5．基因扩增（geneamplification）

在人的慢粒白血病细胞系（HL-60）中，发现了c-myc的扩增，表现为双微体（dounleminutes，DMs）和均染区（Homogeneousstaningregion,HSR）的形成，可通过原位杂交法加以证实。肿瘤基因6.基因甲基化的改变

在肿瘤细胞中可发现癌基因和抑癌基因的甲基化改变，表现为癌基因的低甲基化或去甲基化，或抑癌基因的异常甲基化。有报道在胃癌细胞中发现了c-Ha-ras癌基因的低甲基化，而低甲基化可导致c-Ha-ras癌基因的过度表达。肿瘤基因第二节抑癌基因

抑癌基因(antioncogene)过去常称之为肿瘤抑制基因（tumorsuppressorgene）。关于抑癌基因存在的概念由来以久，人们最初从肿瘤细胞染色体特定部位的缺失推测它的存在。肿瘤基因

细胞遗传学的发展在这方面提供了进一步的证据。当用正常细胞同肿瘤细胞杂交，或将某一条正常细胞染色体导人肿瘤细胞中时，观察到肿瘤细胞的恶性表型受到抑制，从而推测在正常细胞染色体上存在着抑癌基因。肿瘤基因

但最终确定其存在，必须分离到抑癌基因，并对其结构与功能进行详细的分析。1986~l987年国际上有3个实验室成功地分离到第一个抑癌基因——Rb基因的cDNA克隆．从而使抑癌基因研究进入了分子生物学时代。肿瘤基因

近年来又陆续发现了一些新的抑癌基因。目前对抑癌基因尚无明确分类，但近年来由于抑癌基因数量的增多，而其中一些基因在功能上与传统的抑癌基因有很大的不同，为便于了解起见，现将其分成两大类：

肿瘤基因表现为丧失功能的抑癌基因（传统的抑癌基因）

Rb基因FAP相关的抑癌基因

p53基因p21Cipl基因

p73基因p27Kipl

NF1基因FHIT基因

WT1基因PTENErbA基因Kreyl基因

DPC4基因INK4基因肿瘤基因

参与DNA修复抑癌基因（新发现的抑癌基因）

错配修复基因

BRCA1基因

ATM基因肿瘤基因

一、表现为丧失功能的抑癌基因1.Rb基因

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)是婴幼儿眼恶性肿瘤中最常见的一种。大量研究资料证明，位于人类细胞第13号染色体长臂13ql4区域的视网膜母细胞瘤易感基因（retinoblastomasusceptibilitygene，Rb）的缺失或失活，是导致肿瘤发生的主要原因。肿瘤基因

肿瘤基因Rb基因在遗传学上是隐性的，即必须两个等位基因同时缺失形成所谓的缺失纯合子，或一个等位基因缺失而另一基因突变而失活，才能导致基因功能的丧失。肿瘤基因

等位基因的缺失或失活可由以下情况引起：

染色体丢失（13-

）染色体部分缺失（13q-

）等位基因突变（13qRB→I3qrb）肿瘤基因因此，肿瘤细胞的基因型有以下几种可能性：

13qrb／13qrb13qrb／13q-13qrb／13-13q-

／13q-13-

／13-肿瘤基因

有关脂酶D（esteraseD，ED）的研究究揭示了一个饶有兴趣的现象。某些视网膜母细胞瘤患者的红细胞脂酶D活性只有正常人的一半，而在瘤细胞中则其活性为0。

肿瘤基因

这一现象提示，脂酶D基因与Rb基因紧密连锁，Rb基因的缺失导致脂酶D活性的相应下降。肿瘤基因

同时提示，在体细胞中可能只有一个等位基因缺失，而另一个则是正常的，其基因型可能是13q-

／l3RB。体细胞中的正常等位基因如发生突变而失活，则可导致肿瘤发生，其基因型变成13q-

／l3rb。

肿瘤基因

脂酶D的研究不仅为阐明肿瘤发生的机理提供了有力的依据，更重要的是，脂酶D基因与Rb基因的紧密连锁，为Rb基因的分离铺平了道路。

Lee等于1987年首次成功地分离到了Rb基因的cDNA分子克隆：肿瘤基因

以脂酶D的基因组DNA分子克隆为起点，将其两侧远端的DNA片段作为探针，用染色体步移（Chromosomewalking）的方法．从人胚视网膜和胎盘的cDNA文库中筛选Rb的相关基因。肿瘤基因

经过反复筛选，获得了一个与脂酶D相邻的，编码46kbmRNA基因，定名为视网膜母细胞瘤易感基因，简称Rb基因。肿瘤基因

检查了6例视网膜母细胞瘤病人，发现其中2例基因完全不表达，其他4例则表达下降，而且表达的mRNA分子长度减少至4.0kb左右，对进行序列分析的结果表明，它编码一个含816氨基酸残基的蛋白，经计算机检索未发现与该基因同源的序列。肿瘤基因

以后各国学者对Rb基因的结构与功能进行了大量的研究：现已明确，Rb基因的基因组DNA总长为200kb，有27个外显子，转录为4.7kbmRNA，编码含928氨基酸残基的蛋白质，其分子量为110~114kD。肿瘤基因

常见的三种蛋白产物的分子量分别为

110kD未磷酸化形式

112kD磷酸化形式

114kD

肿瘤基因

其磷酸化程度在细胞周期中发生周期性变化：

G0

期、G1期蛋白未磷酸化

S期、G2期大多数蛋白已磷酸化

肿瘤基因Rb蛋白磷酸化程度与细胞周期调节因子cde2／cde28的活性呈正相关。未磷酸化型Rb蛋白可能是抑制细胞增殖的活性型。肿瘤基因Rb基因可与某些肿瘤病毒的转化蛋白形成稳定的复合物，其中包括SV40抗原，腺病毒EIA蛋白和人乳头瘤病毒E6/E7蛋白，故可能对肿瘤病毒的转化起抑制作用。肿瘤基因Rb蛋白还可以对细胞内转录因子、生长因子起调控作用：

肿瘤基因

研究资料表明，在正常细胞内可能存在着Rb蛋白的靶蛋白。例如，细胞内谷胱甘肽S转移酶能同Rb基因的LT/EIA结合，这种结合同Rb蛋白的生长抑制功能有关。一旦Rb蛋白同SV40或腺病毒基因组的相应部位结合，或在位点发生了点突变，就可能丧失其生理功能。肿瘤基因

转录因子E2F也能与Rb蛋白形成复合物，故Rb蛋白可通过同样的机理来调节E2F因子的转录活性。肿瘤基因

另外，Rb基因可抑制细胞内癌基因的表达。例如，用Rb基因转染NIH/3T3细胞可抑制c-fos癌基因在G1晚期的表达。肿瘤基因Rb蛋白还可通过同c-myc，N-myc，erbB-2／neu等癌基因产物相结合来调节细胞的增殖和分化。肿瘤基因2．P53基因在过去十几年里，人们对p53基因的认识经历了一个漫长的历程:

最初是通过在鼠类细胞中p53蛋白与DNA肿瘤病毒抗原的结合而发现的。肿瘤基因

随后克隆到了p53基因，并证明它能转化鼠类细胞，而且发现在恶性转化的哺乳动物细胞中，p53基因的表达增高。这些资料提示，p53的作用类似于myc或ras，因此可能是一个癌基因。肿瘤基因

随着研究的深入，发现了一些矛盾的现象。在对大肠癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤进行大量细胞遗传学研究时发现，第17号染色体短臂经常丢失。按照Knudson关于抑癌基因作用模式推测，丢失的染色体片段中可能存在着抑癌基因。肿瘤基因

由于己知p53基因定位于17p13.1，所以有可能成为等位基因丢失的靶基因．因此对肿瘤细胞中残留的等位基因进行了序列分析，发现绝大多数残留的p53等位基因己经经历了点突变。这种等位／突变的模式表明，p33基因很可能象Rb基因那样，是一个抑癌基因。肿瘤基因

进一步的研究表明，能够使鼠类细胞发恶性转化的基因实质上是突变型p53基因，而野生型p53基因不仅不诱发转化，相反地能抑制转化。肿瘤基因

根据现有资料，基因全长16～20kb，由11个外显子组成．产生长25kb的mRNA，编码含393个氨基酸残基的蛋白，分子量为53kD。肿瘤基因

蛋白有5个高度保守区，分别位于第13～19、117～142、171～192、236～258及270～282密码子区域。基因突变大多数发生于外显子，与上述保守区基本相符。肿瘤基因检查等位基因的缺失或突变可采用以下几种方法：①限制性DNA片段长度多态性分析②单链DNA构型多态性分析③直接DNA测序肿瘤基因①限制性DNA片段长度多态性（restrictionDNAfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析：

提取DNA，用适当的限制性内切酶酶解，再用电泳分离。正常细胞的两个等位基因是杂合的，因而显示不同的带型。如果有一个等位基因缺失，就会显示单一的带型，这种现象称为杂合性丢失（lossofheterozygosity,LOH）；肿瘤基因②单链DNA构型多态性（singleStrandconformationpolymorphism,SSCP）分析：正常细胞在变性后，经聚丙烯酸胺凝胶电泳，呈现一定的带型。如其中某一个单链发生了突变，就可使单链的构型发生变化，结果使其电泳速度发生变化，导致额外电泳带的出现；

肿瘤基因③直接DNA测序：

由于突变经常发生于第5～8外显子，故可设计这4个外显子上下游的引物进行聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增，然后分别进行DNA测序（DNAsequencing）。用这一技术不仅可以测定等位基因缺失或突变的性质，还可对其进行精确的定位。肿瘤基因

正常野生型p53（wtp53）基因的转录产物不稳定，半衰期仅20分钟，而突变型p53（mp53）的半衰期则延长至1.4～7小时，所以如用原位杂交或免疫组化方法来检测，则不能检测到wtp53。而只能检测到mp53的mRNA和蛋白。肿瘤基因

只有wtp53蛋白才具有抑癌活性，mp53蛋白则不仅丧失了抑癌活性，而且还能与wtp53蛋白结合使其丧失抑癌功能。所以当一个p53等位基因发生突变时，就足以使细胞呈现恶性表型。肿瘤基因

这一点与必须两个等位基因同时失活不同，说明p53基因突变的遗传型是显性的。这一特殊的遗传学现象称之为显性负效应（dominantnegativeeffect）。肿瘤基因wtp53基因的功能是多方面的，主要有以下几面：①转录因子活性②wtp53信号区的功能肿瘤基因①转录因子活性

p53蛋白是一个转录因子，可通过转录活化区与通用转录因子（multisubunittranscriptionfactor,TF11D）结合并相互作用。肿瘤基因TF11D是TATA结合蛋白（TATAbindingprotein.TBP）和TBP相关因子（TBPassociatedfactor,TAF）结合而成的复合物。与TF11D中的TAF结合，TF11D再通过TBP与其下游基因启动子中的TATAbox结合而发挥作用。肿瘤基因wtp53的转录活性受腺病毒EIB蛋白及癌基因产物MDM2蛋白的抑制。MDM2通过与wtp53转录活性区相互作用而起到抑制mp53活性的作用。肿瘤基因②wtp53信号区的功能

此区34个氨基酸中有12个脯氨酸，含5个脯-X-X-脯重复序列，产生一个SH-3区结合部位。wtp53基因借助于SH-3区的结合活性，把它同信息传递通道直接联系起来，激活某些靶基因如p21／WAFI／cip1的转录活性。肿瘤基因WAF1的蛋白产物p21是细胞周期调节因子，可有效抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，从而阻断细胞周期的演进。肿瘤基因

总之，wtp53正是通过其转录活性和信号传递功能而发挥其抑癌功能的，主要表现为调节细胞周期和诱导细胞凋亡(将在其他章节中详细加以叙述)。肿瘤基因3.p73基因

p73基因的发现极为偶然。

Kaghad等于1997年在利用针对IRS-l结合区的寡核苷酸探针与COS细胞的cDNA文库进行杂交分析中，检出一假阳性克隆它与IRS-l结合区无任何同源性，却与p53基因的大部分保守序列均同源。根据此序列编码的蛋白的分子量，将其命名为p73基因。肿瘤基因

利用荧光原位杂交技术将基因定位于lp36区。此区域由于在神经母细胞瘤及其它多种肿瘤细胞中常发生缺失因而被认为可能存在着某种抑癌基因。肿瘤基因p73基因由13个外显子和12个内含子组成，其表达产物p73蛋白与p53蛋白有同源性：

p73蛋白和p53蛋白一样具有4个主要的功能区，其氨基端的转录激活结构域与p5329％同源，中部的DNA结合结构域与p5363％同源，p53的6个突变热点p73也完全保守，寡聚结构域有38％同源，而羧基端则未检出明显同源。肿瘤基因

迄今共发现6种p73基因的转录剪切变异体，它们分别为:

p73α

p73β

p73γ

p73δ

p73ε

p73φ肿瘤基因p73α由636个氨基酸残基组成，是全长的p73蛋白，p73β则由499个氨基酸残基组成，这是由于p73基因转录时将外显子13剪切而缺失了96个氨基酸残基，并导致开放读框的改变。p73β除了最后5个氨基酸残基为其所特有外，其余均与p73α的相应序列完全相同。肿瘤基因

虽然哺乳动物的p53蛋白与p73蛋白的羧基端没有明显的同源性，但是人p73α蛋白的羧基端与最近在无脊椎动物中发现的p53蛋白同源，说明p53基因可能是从更为原始的“p73样”基因进化而来的。肿瘤基因

利用酵母菌杂交系统研究蛋白各种剪切变异体之间相互作用时，发现p73β蛋白形成同源二聚体的能力很强，类似于p53，而p73α

则很弱。P73α和p73β蛋白与p53之间有较弱的异型间相互作用。肿瘤基因

这些结果表明，p73蛋白各种剪切变异体能形成同型或异型相互作用，而且提示这些作用有可能发生于体内，以便协调整个p53-p73系统的功能。肿瘤基因p73基因在染色体上定位的特殊性以及其蛋白产物与p53蛋白在结构上的相似性，均提示它可能是一个抑癌基因，并且可能与p53蛋白在功能上有相似性：肿瘤基因

实验证明，p73过表达时能抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，而其突变体则无此功能。

p73还能激活部分p53的靶基因，但对绝大多数p53靶基因其作用则明显弱于p53基因。肿瘤基因

例如p73α和p73β对p21的诱导水平分别比p53低了6倍和3倍。但有趣的是，对某些靶基因如14-3-3a和PIG7的诱导水平却远远高于p53。因此，虽然p53和p73均能诱导细胞凋亡，但二者导致调亡的信号途径可能有所不同。肿瘤基因

另外，不同型p73蛋白的生物功能强弱不同，其中以p73β的功能最强。肿瘤基因

随着对p73作用分子机理研究的深入，发现了一些矛盾的现象：①在各种肿瘤中均检测不到p73的突变，甚至在一些癌细胞中发现了p73的高表达；肿瘤基因②p73-/-小鼠中见不到肿瘤易患现象，但却有严重的发育异常，尤其是脑和免疫系统。反之，p53-/-小鼠易患肿瘤，却无明显的发有异常，这提示有一更原始的基因能够替代p53而完成小鼠某阶段的发育，而这个基因是否就是p73呢？肿瘤基因③三种经典的病毒癌蛋白（SV40大T抗原、腺病毒EIB55kD和HPVE6）均能作用于p53并使之失活，从而使宿主细胞发生恶性转化，却不能与p73蛋白相结合。肿瘤基因

以上现象说明，p73抑癌和失活的分子机理尚有待于进一步研究阐明。肿瘤基因4．与家族性腺瘤样息肉病

(familialadenomatouspolyposis,FAP）相关的抑癌基因

FAP过去通常称之为家族性结肠息肉病（familialpolyposiscoli,FPC），是一种常染色体显性遗传病。

肿瘤基因近年来对FAP与抑癌基因之间的关系研究得较多:

APC(adenomatouspolyposiscoli)基因

MCC（mutatedcolorectalcancer）基因

DCC（deletedincolorectalcarcinoma）基因肿瘤基因APC(adenomatouspolyposiscoli)基因是FAP的易感基因，定位于第5号染色体长臂（5q21），由15个外显子及14个内含于组成，其mRNA全长为8535bp，编码2842个氨基酸残基的蛋白，分子量为500kD，与酵母菌中调节ras族癌基因的基因中一个小片段有同源性。肿瘤基因

其基因产物定位于细胞质，APC不仅同FAP有关，而且同散发性结肠癌、肺癌等肿瘤有关。肿瘤基因

MCC（mutatedcolorectalcancer）基因

也是FAP的易感基因，定位于第5号染色体长臂（5q21），由17个外显子16个内含子组成，其mRNA全长为4181bp，编码829个氨基酸残基的蛋白，分子量为93kD。肿瘤基因

在染色体上与APC相邻，同G蛋白偶联的乙酰胆碱蕈毒碱受体的一小片段有很高的同源性。

MCC不仅同FAP及结肠癌有关，还同小细胞肺癌及非小细胞肺癌等有关。肿瘤基因DCC（deletedincolorectalcarcinoma）基因定位于18号染色体长臂（18q21.3），基因全长约370kb其mRNA长10～12kb，编码含750个氨基酸残基的蛋白，分子量为190kD。其序列同神经细胞粘附分子有同源性。肿瘤基因DCC蛋白与细胞同细胞及细胞同基质之间相互关系有关。在结肠癌中可见到DCC基因的丢失。肿瘤基因5.NF1基因

NF1（neurofibromatosistypel）基因是多发性神经纤维瘤的易感基因，定位于第17号染色体长臂（17q11.2）。肿瘤基因

基因全长约6okb，转录成11~13kbmRNA，编码2485个氨基酸残基的蛋白。NF1蛋白同ras族癌基因编码的GTP酶活性蛋白有一定的同源性。肿瘤基因NF1蛋白可能为抗增殖蛋白，表现为对rasp21蛋白的负调节和阻止ras介导的有丝分裂信号。NF1失活足以产生良性的神经纤维瘤，但在恶变时可能还有别的基因参与。肿瘤基因6.WT1基因

WT1（Wilmstumorstype1）为Wilms瘤(肾恶性胚胎瘤)的易感基因，定位于第17号染色作短臂（17p13），基因全长约59kb，转录成3kbmRNA，编码345个氨基酸残基的蛋白。肿瘤基因

该蛋白含4个锌指纹族，显示与特异性DNA结合的特性，能同上皮细胞生长因子受体EGFR-l启动子区域的CGCCCCCGC序列结合，从而抑制其转录活性。肿瘤基因

表达有发育阶段特异性及组织特异性：在胚胎肾上皮、睾丸和卵巢，及一些造血细胞中有表达．但在成人细胞中不表达。在纯合性缺失的Wilms瘤中无WT1mRNA表达，但在绝大多数Wilms瘤中呈高表达。肿瘤基因

推测其突变基因可能也象突变型p53那样，表现出显性负效应。突变的基因可过度表达，并对野生型等位基因起抑制作用。肿瘤基因7.ErbA基因同P53基因一样，erbA基因以前一直被认为是癌基因。用含erbA和erbB基因的禽成红细胞增多症病毒（AEV）感染红细胞系造血细胞，可产生红白血病。肿瘤基因

近年来的研究表明，野生型erbA基因是一种抑癌基因编码正常甲状腺素受体．可抑制细胞增值，促进终未分化，而突变型erbA基因也象p53基因那样仅有显性负效应，不但无抑癌作用，反而能抑制野生型erbA的作用。肿瘤基因8.Krevl基因日本学者野田亮等用插入到真核细胞表达性质粒的人包皮成纤维细胞cDNA文库提取的总DNA，转染经K-ras癌基因转化的小鼠NIH3T3细胞，从中筛选出扁平型表型逆转的细胞克隆。肿瘤基因

最后从这些克隆中分离到一个能特异地抑制上述细胞恶性表型的cDNA片断，命名为Krevl基因。有关这一基因的结构与功能尚少报道，可能与人类肿瘤关系不大。肿瘤基因

9.INK4基因

INK4基因的蛋白产物是一种细胞周期抑制蛋白（CKI）。目前已知的CKI可分为两大类：肿瘤基因INK4（inhibitorofCDK4）——特异地抑制CyclinD1·CDK4和cylinD1·CDK6的磷酸化激酶活性；

Kip（kinaseinhibitionprotein）——抑制现己知的大多数Cyclin·CDK的磷酸化激酶活性。肿瘤基因

现已知的INK4包括

pl6INK4ap15INK4bp18INK4cp19INK4d

其蛋白质结构与功能具有高度相似性。肿瘤基因

为pl6INK4a、p15INK4b编码的基因位于第9号染色体长臂9q21区。

pl6INK4a基因又称多肿瘤抑制因子（multipletumorsuppressorl,MTSI）、细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制因子（cyclin-dependentkinase4inhibitor,CDK4I），是Kamb和Nobori在1994年发现的。肿瘤基因pl6INK4a基因长约85kb，包括3个外显子和2个内含子，cDNA全长444bp，编码由148个氨基酸残基组成的。分子量为16kD的蛋白质。该类蛋白质的N-末端具有Cyclinbox同源框及由4个回钩状重叠组成的二级结构，该保守结构中氨基酸变异与肿瘤发生之间的相关性高于其他氨基酸部位。肿瘤基因

最近发现，小鼠INKK4a基因组能产生α、β两种转录产物，两者长度基本相同。α产物编码pl6INK4a

，β产物编码分子量为19kD的蛋白质称之为p19ARF

（alternativereadingframe，ARF）。INK4a基因和ARF基因分别具有不同的启动子，产生不同的基因产物。肿瘤基因pl6INK4a基因的转录产物由外显子lα，外显子2和外显子3组成，而ARF基因的转录产物则由外显子1β，外显子2和外显子3组成。虽然INK4a基因和ARF基因共有外显子2和外显子3，但由于读框互不相同，他们编码的蛋白质序列没有同源性。肿瘤基因

两种抑癌机理；

pl6INK4a

／pRb途径

p19ARF

／p53途径肿瘤基因pl6INK4a

／pRb途径：

pl6INK4a与CyclinD1竞争性结合G1期激酶CDK4／CDK6．，抑制其对Rb蛋白（pRb）的磷酸化作用，使游离的转录因子E2F-l与未磷酸化的pRb结合，结果依赖于E2F-1转录的基因不能被转录，从而抑制DNA合成，抑制细胞由G1期进入S期，抑制细胞分裂。肿瘤基因pl6INK4a还可间接抑制包括DNA合成在内的多种生化反应，从而抑制细胞周期进程。

pl6INK4a失活可导致细胞周期紊乱。肿瘤基因p19ARF

／p53途径：

wtp53基因的表述受mdm2癌基因产物MDM2的负调控。在肉瘤和其他一些肿瘤中，MDM2过度表达，所以尽管wtp53基因本身无突变，却检测不到wtp53mRNA的存在。肿瘤基因p19ARF的N-端结构域可以与MDM2的C-端结构域结合，阻止MDM2进入核内并加速其降解，因而可以提高wtp53的稳定性和在细胞核中的水平,抑制肿瘤发生。肿瘤基因pl6INK4a基因中最常见的失活机理为纯合性缺失，其他两种可能的机理则为突变和甲基化。在多种肿瘤中均可发现pl6INK4a基因的异常：肿瘤基因在胰腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、急性白血病、恶性黑色素瘤、鼻咽癌等人类肿瘤中的pl6INK4a纯合性缺失率较高在胰腺癌、食管鳞癌、家族性恶性黑色素瘤及胆管癌等肿瘤中则pl6INK4a的突变率较高在乳腺癌及胃癌中pl6INK4a的突变率较低肿瘤基因

近年来发现，非小细胞肺癌中pl6INK4a5`-CpG岛的甲基化达33％，在对大肠癌、前列腺癌、乳腺癌等原发肿瘤和细胞系的检测中也发现了pl6INK4a5`-CpG岛的高甲基化。由此可见，pl6INK4a

基因的异常甲基化也可能在肿瘤发生中起着重要的作用。肿瘤基因10．p21Cip1

基因

细胞周期抑制蛋白CKI包括INK4和KiP

两大类。现己知的Kip包括p21Cip1

（cyclininhibitionprotein1）、p27Kip1(kinaseinhitionprotein)及p57Kip2三种细胞周期抑制蛋白。肿瘤基因

它们在N-末端的结构和功能具有高度的相似性。p27Kip1与p21Cip1N-端间具有42％的同源性，p27Kip1与p57Kip2N-端间具有47％的同源性。他们均可特异地抑制下列蛋白激酶活性，具有同INK4相似的功能：

CyclinD1·CDK4CyclinD1·CDK6CyclinE·CDK2CyclinA·CDK2肿瘤基因1993年Harper和EIDeiry两个试验小组同时分离出p21基因的cDNA。并根据其功能给予了不同的命名，如CDK相互作用蛋白（CDKinteractingprotein1，Cip1），野生型p53活化的片段（wildtypep53-activatedfragment1,WAF1)等。肿瘤基因p21基因定位于第6号染色体短臂（6p21.2），其基因组DNA长度为85kb,由3个外显子组成。其cDNA长约2.1kb。肿瘤基因

在p21编码区上游24kb和大于8kb处有2个p53结合区，p21蛋白定位于细胞核中，由164个氨基酸残基组成，富含精氨酸。其N末端第21~26个氨基酸残基可与CyClinD,E结合，C末端第124~164氨基酸残基可与PCNA结合，中间第49～72对氨基酸残基可与CDK2结合。肿瘤基因p21是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白。它能与多种Cyclin·CDK复合物结合，通过多种途径对细胞周期演进起抑制作用。肿瘤基因p21蛋白能与CyclinD1·CDK4,CyclinE·CDK2结合使其丧失磷酸激酶活性，使pRb不能发生磷酸化，从而使细胞周期停滞于G1期；

p21蛋白还能与增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）结合，使PCNA不能与DNA聚合酶δ

形成复合物，从而抑制DNA合成。肿瘤基因p21基因的活化和表达可通过以下两个途径来完成：①依赖P53途径②非依赖p53途径肿瘤基因①依赖p53途径当细胞受到损伤时（如受γ辐射），在wtp53+/+

细胞中常有wtp53,p21表达升高，细胞停滞于G1期，而在p53-/-细胞中则无p21升高，细胞也无G1期停滞，说明wtp53作为转录因子，可启动p21表达，使细胞停滞于GI期，以利于DNA修复，维持细胞遗传信息的稳定性。肿瘤基因②非依赖p53途径生长因子（PDGF、FGF、EGF、TGFβ）等作为细胞外信号，刺激p53-/-的静止期细胞，通过细胞分裂素活化的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)途径调节p21转录。佛波酯、γ干扰素等可诱导wtp53-/-的人类白血病细胞系的p21表达，并出现单核巨噬细胞系分化相关的生长停滞。肿瘤基因

在大多数肿瘤细胞中未发现p21突变，而只见到其表达改变。在黑色素瘤细胞间变痣、SV40转化的黑色素瘤细胞和转移的黑色素瘤中，其表达水平依次显著降低，表明p21表达与黑色素瘤的发生、发展有密切关系。肿瘤基因

在43例非小细胞性肺癌及其对应的正常组织中，通过mRNA检测及免疫组化显示，在正常肺组织中p21mRNA及蛋白表达很低，而在肺癌组织中p21mRNA及蛋白均高表达，其机理尚不太清楚。肿瘤基因

11．p27Kip1

p27Kip1是Polyak等于1994年在TGFβ处理的生长抑制细胞，及接触抑制的细胞系中发现的另一种分子量为27kD的耐热细胞周期抑制蛋白。肿瘤基因

它在体外与CyclinE·CDK2，CyclinD1·CDK4紧密结合，其活性的发挥依赖于三者间的化学剂量关系。CyclinE·CDK2的浓度是细胞通过细胞周期关卡的关键因素，而p27Kip1则特异地抑制CyclinE·CDK2的激酶活性。肿瘤基因

人p27Kip1是由198个氨基酸残基组成的热稳定蛋白，与p21Cip1

在N-端有高度同源性。其末端21~87位点的60个氨基酸残基具有两个Ser磷酸化位点，具CDK激酶抑制活性。肿瘤基因153～169位的17个氨基酸序列为核定位序列，该序列在Kip的三个成员平均存在，与其细胞周期调控功能密切相关。p27Kip1的C末端有一个Thr磷酸化位点，与其H1组蛋白磷酸化抑制作用有关。肿瘤基因

大量实验证明，在TGFβ处理的细胞系、有接触抑制的细胞系及多种外源性生长抑制因子作用的细胞系中p27Kip1表达量明显增多。在TGFβ处理前后细胞内p27Kip1的mRNA总量无明显变化，但在处理后G1末期细胞中游离的p27Kip1浓度增加。肿瘤基因

在TGFβ处理的细胞中加入过量的CyclinD1·CDK4可以使滞留于G1期的细胞重新分裂。这些资料说明，抑制细胞周期的最关键因素是细胞内游离p27Kip1的量，而不是其总量。肿瘤基因

另外，p27Kip1具有抑制染色质H1组蛋白磷酸化的作用。细胞内DNA聚合酶作用的发挥依赖于H1组蛋白磷酸化介导的染色质结构变化，抑制H1组蛋白的磷酸化也就间接地抑制了DNA的合成。肿瘤基因p27Kip1具有多种细胞周期抑制作用，虽其作用弱于p21Cip1

，但对正常组织的损伤明显低于后者，因此有可能作为基因治疗中可供选择的靶基因。肿瘤基因

12．FHIT基因

FHIT基因是1996年Ohta等用外显子捕获法克隆到的一个人类基因。肿瘤基因

由于该基因定位于第3号染色体短臂（3p14.2），该处存在脆性部位FRA3B，而且．根据其推算的蛋白质序列与具有三价组氨酸结构域的HIT蛋白质高度同源，因此定名为脆性组氨酸三联体（fragilehistidinetriad,FHIT）。肿瘤基因FHIT基因cDNA全长1.1kb，具有10个外显子，其开放阅读读框（openreadingframe）起于外显子5，止于外显子9。

肿瘤基因

关于FHIT异常与肿瘤发生之间的关系已有许多研究报道，迄今尚未发现有关FHI下基因突变的报道。肿瘤基因

有报道在38例有第3号染色体复制（chromosomalduplication）异常的非小细胞肺癌病人中，50%有3p特定序列的缺失，83%有FHIT基因的杂合性丢失（lossofheterozygosity,LOH),说明FHIT等位基因的丢失可能在肿瘤发生中起着重要作用。肿瘤基因13.PTEN

PTEN／MMAC1/TEP1基因是1997年由3个研究组分别发现和命名的一种抑癌基因。

肿瘤基因PTEN基因又名MMAC1和TEP1。PTEN——phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10MMAC1——mutatedinmultideadvancedcancersTEP1TGFβ-regulatedandepithelialcellenrichedphosphatase肿瘤基因PTEN定位在10q23.3上，并已被克隆。共有9个外显子，mRNA为5.5kb。PTEN蛋白的主要结构功能区位于N-端，由个1209个核苷酸编码403个氨基酸残基组成一条多肽链。肿瘤基因在第122～123位的氨基酸序列（IHCKAGKGRTG）符合酪氨酸磷酸酶的核心基序（HCXXGXGRX），是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。肿瘤基因

目前对PTEN的作用机理已有较多报道，认为PTEN的抑癌作用可通过以下途径来完成：

①FAK途径②三磷酸脂酸肌醇激酶途径③丝裂原激活的蛋白激动途径

肿瘤基因①FAK途径锚着点激酶（FAK）是整合素(integrin)介导的信号途径中的一个关键分子。整合素通过与细胞外基质相互作用而被活化，继而激活FAK，促使细胞增殖、侵袭和转移。

PTEN则可直接使FAK去磷酸化，从而抑制细胞生长。肿瘤基因②三磷酸脂酸肌醇（PI3）激酶途径三磷酸磷脂酸肌醇（PIP）位于细胞膜上，是一种细胞生长调控途径中的关键分子，主要作用是刺激细胞生长和阻断凋亡。是胰岛素生长因子（IGF）和上皮生长因于（EGF）等一些细胞生长因子在细胞内的第二信使。肿瘤基因

生长因于与膜上受体结合，激活PI3激酶，从而使信使前体PIP2磷酸化生成PIP3。后者随后激活信号传导系统中的一系列激酶包括丝苏氨酸激酶（Akt）。这些酶可促使细胞进入分裂周期,并阻止细胞周亡。肿瘤基因PTEN能抑制PI3激酶的磷酸化作用，阻止PIP2向PIP3转化从而阻断了Akt及其下游基因的活性，从而起到了抑癌作