免疫学检验技术 课件汇 马春玲 13 免疫组织化学技术-23 免疫学检验的质量控制

第十三章免疫组织化学技术免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库又称免疫细胞化学技术，是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。免疫组织化学技术概念免疫组织化学技术根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：酶免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术免疫组织化学技术免疫组织化学技术的分类免疫组织化学技术的基本过程1、抗原的提取与纯化2、免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化3、将标记物与抗体结合形成标记抗体4、标本的处理与制备5、抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应6、观察结果免疫组织化学技术第一节免疫组化技术基本知识免疫组织化学技术职业教育医学检验技术专业教学资源库一、标本制作（一）标本的主要来源主要有：①活体组织②各种体液及穿刺液③培养细胞等

标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。第一节免疫组化技术基本知识（二）标本的固定与保存

2．固定剂的选择3．固定方法1．组织材料的固定目的

①浸泡法②灌注法适用于动物实验研究主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织固定。第一节免疫组化技术基本知识（三）玻片的处理玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂第一节免疫组化技术基本知识（四）切片方法的选择二、抗原处理片的处理（一）进行抗原的暴露和修复的原因1.固定液的影响2.抗体制备的影响

（二）抗原的暴露

主要采用酶消化的方法在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的酶

在日常工作中用胰蛋白酶消化即可

第一节免疫组化技术基本知识二、抗原处理片的处理（三）热诱导的抗原修复抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率。压力锅法微波处理法水浴锅法第一节免疫组化技术基本知识三、抗体处理抗体是免疫组织化学技术的首要试剂

（一）抗体的选择（二）抗体的稀释（三）抗体的合理保存高度特异性和稳定性适当的比例保持抗体的生物活性

第一节免疫组化技术基本知识四、常用标记物（一）荧光素FITC、RB200（二）酶HRP（三）生物素-亲和素系统（四）免疫金标记技术（五）免疫铁蛋白技术第一节免疫组化技术基本知识五、免疫组织化学技术的结果判断（一）对照染色设计通常需针对第一抗体设立对照1.阳性对照已知抗原阳性的切片，免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性2.阴性对照确证不含已知抗原的标本，目的是排除假阳性3.阴性试剂对照4.自身对照指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。第一节免疫组化技术基本知识五、免疫组织化学技术的结果判断阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆)型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也应视为阳性表达（二）阳性结果第一节免疫组化技术基本知识五、免疫组织化学技术的结果判断（三）阴性结果

阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别

1.分布位置

特异性反应必须分布于特定抗原部位非特异性反应无一定的分布规律

第一节免疫组化技术基本知识五、免疫组织化学技术的结果判断2.显色强度

特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞3.其他

在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色

第一节免疫组化技术基本知识六、质量控制质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。（一）试剂质量控制抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键

（二）操作过程质量控制

实验操作标本的质量控制（三）仪器设备和器具的质量控制第一节免疫组化技术基本知识第二节

荧光免疫组织化学技术免疫组织化学技术职业教育医学检验技术专业教学资源库第二节荧光免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术概述利用抗原抗体特异性结合的原理，先用荧光素标记已知抗体并以此作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后，即会发出一定波长的荧光，进而对组织中的某种抗原进行定性、定位和定量分析。第二节荧光免疫组织化学技术一、标本制作常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三大类，按不同标本性质可制作涂片、印片或组织切片等。（一）载玻片和盖玻片的处理载玻片和盖玻片要厚薄均匀、洁净及透光性好

一、标本制作（二）制片1．组织切片组织材料可制备成冰冻切片或石蜡切片。

2．印片组织材料也可制成印片。3．涂片细胞或细菌要制成涂片，涂片应薄且均匀。第二节荧光免疫组织化学技术一、标本制作（三）标本的固定主要目的是：

1.防止细胞或切片从玻片上脱落

2.去除妨碍抗原抗体结合的类脂

3.便于保存。除活细胞外，其他标本应在染色前以适当的方式固定。

（四）标本片的保存固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需保存，置-20℃下低温干燥保存。第二节荧光免疫组织化学技术二、荧光抗体标记及染色荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与特异性抗体通过共价键的方式结合而成。其制备过程通常包括抗体的标记、纯化和鉴定三步。在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置于带盖的湿盒内，37℃温育30min。检测不耐热抗原以4℃过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜检。第二节荧光免疫组织化学技术第三节

酶免疫组织化学技术免疫组织化学技术职业教育医学检验技术专业教学资源库酶免疫组织化学概述

酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。第三节酶免疫组织化学技术一、标本制作常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片酶免组织化学检验技术可分为酶标记抗体免疫组织化学染色法非标记抗体酶免疫组织化学染色法第三节酶免疫组织化学技术二、酶标记抗体的免疫组化染色法

（一）原理酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、定位、定量检测的目的。第三节酶免疫组织化学技术二、酶标记抗体的免疫组化染色法（二）技术类型

1.直接法形成抗原一抗体一酶复合物2.间接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物3.酶标抗体三步染色法为间接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物第三节酶免疫组织化学技术二、酶标记抗体的免疫组化染色法直接法间接法优点操作简便特异性强检测敏感性高制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法操作较为繁琐第三节酶免疫组织化学技术三、非标记抗体酶免疫组化染色法（一）原理该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。第三节酶免疫组织化学技术三、非标记抗体酶免疫组化染色法（二）技术类型1.酶桥法用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色第三节酶免疫组织化学技术三、非标记抗体酶免疫组化染色法第三节酶免疫组织化学技术三、非标记抗体酶免疫组化染色法2.PAP法即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶（P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连接起来第三节酶免疫组织化学技术三、非标记抗体酶免疫组化染色法三、非标记抗体酶免疫组化染色法3.双桥PAP法

该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。4.APAAP法

APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。第三节酶免疫组织化学技术四、酶免疫组化染色中的常用酶及显色底物酶底物颜色辣根过氧化物酶（HRP）二氨基联苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘红色4-氯-1-萘酚灰蓝色碱性磷酸酶（ALP）α-萘酚磷酸盐+快蓝深蓝色α-萘酚磷酸盐+快红红色溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）+氮蓝四唑（NBT）紫蓝色第三节酶免疫组织化学技术第四节

亲和组织化学技术免疫组织化学技术职业教育医学检验技术专业教学资源库亲和组织化学技术概述亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合形成相应复合物，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、植物凝集素与糖类、SPA与IgG、链霉亲和素与生物素等。第四节亲和组织化学技术一、生物素-亲和素法生物素可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素也称抗生物素，每个亲和素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。第四节亲和组织化学技术一、生物素-亲和素法常用的技术类型有：1.标记亲和素-生物素法（LAB法）将亲和素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，提高了检测抗原的敏感性。第四节亲和组织化学技术第四节亲和组织化学技术一、生物素-亲和素法一、生物素-亲和素法2.桥联亲和素-生物素法（BAB法）先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。第四节亲和组织化学技术一、生物素-亲和素法第四节亲和组织化学技术一、生物素-亲和素法3.ABC法此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的生物素化抗体或生物素化第二抗体相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。

第四节亲和组织化学技术一、生物素-亲和素法第四节亲和组织化学技术二、SPA法SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等的IgGFc结合的能力，这种结合不会影响抗体的活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。第四节亲和组织化学技术二、SPA法第四节亲和组织化学技术三、链霉亲和素—生物素技术链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就组成酶标链霉亲和素-生物素方法（LSAB）。

LSAB法的特点:①特异性强；②分子量小，穿透力强，放大效应远超ABC法，故其敏感性更强；③等电点中性更适合组织，可明显减少非特异性染色，低背景着色使特异性着色更清晰；④操作时间缩短，更简便。第四节亲和组织化学技术三、链霉亲和素—生物素技术第四节亲和组织化学技术第四节亲和组织化学技术四、凝集素法一种凝集素具有专一性结合某种特异性糖基的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。第四节亲和组织化学技术四、凝集素法一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型并反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的变化。标记了相应示踪物的凝集素可用来：①作为细胞分化和成熟的标记②作为细胞特殊类型的标记③肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，也可用凝集素检测出肿瘤细胞。四、凝集素法常用下列染色法：①直接法—标记物直接标记凝集素，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合②间接法—将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上③糖—凝集素—糖法—利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，未结合部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个“三明治样”的糖—凝集素—糖结合物。第四节亲和组织化学技术第五节

免疫标记电镜技术免疫组织化学技术职业教育医学检验技术专业教学资源库一、金免疫组织化学技术免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如SPA)等作为探针，能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。一、金免疫组织化学技术（一）免疫金（银）光镜染色技术基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag＋)还原成银原子(Ag)，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成，本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”不断变大，最终使抗原位置得到更清楚的放大，在光镜下就可观察到被放大的抗原位置呈现黑色或黑褐色。

第五节免疫标记电镜技术一、金免疫组织化学技术第五节免疫标记电镜技术一、金免疫组织化学技术（二）免疫金电镜染色技术

胶体金与镍网上待检标本的相应蛋白质发生结合，由于胶体金具有高电子密度，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，从而可对细胞膜上或细胞内的蛋白质进行定性与定位分析。第五节免疫标记电镜技术二、金酶标记免疫电镜技术

酶标记免疫电镜技术是用酶标抗体与组织或细胞抗原发生特异性结合后，加酶底物显色，在电镜下观察显色反应的强度。它是将电镜的高分辨力与酶免疫技术的特异性结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定性分析的一种高度精确、灵敏的方法。

第五节免疫标记电镜技术三、免疫胶体铁细胞组织化学技术

胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小和电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原（抗体）的定位研究。第五节免疫标记电镜技术第六节免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术职业教育医学检验技术专业教学资源库一、免疫组织化学技术的临床应用（一）荧光免疫组织化学技术的应用：1.在自身免疫性疾病中的应用2.细菌和病毒的快速鉴定3.寄生虫的检测与研究（二）酶免疫组织化学技术的应用：1.提高病理诊断准确性2.癌基因蛋白的临床应用3.对肿瘤细胞增生程度的评价4.发现微小转移灶5.在肿瘤分期上的意义6.指导肿瘤的治疗第六节免疫组织化学技术的应用二、免疫组织化学技术的拓展（一）荧光激活细胞分类仪（FACS）（二）共聚焦显微镜技术（三）免疫组织化学—显微切割技术第六节免疫组织化学技术的应用第十四章

免疫细胞及其功能检验技术免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞等。通过分离、纯化免疫细胞及其亚群，并对其数量和功能测定，可以判断机体免疫功能状态，对指导临床实践和科学研究具有重要意义。前言第一节免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离方法很多，主要根据细胞表面标志、理化性状和细胞功能等特征。应根据实验目的、所分离的目的细胞群种类、数量和纯度等要求选择分离方法。所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性兼顾细胞纯度和获得率。一、白细胞的分离加抗凝血于试管中室温或37℃中静置（30-60min）分层结果示意图（一）自然沉降法（二）高分子聚合物沉降法抗凝血与等量3%明胶或6%右旋糖酐溶液混匀室温或37℃中静置（30～60min）分层结果与自然沉降法类似优点：速度快、得率高不足：白细胞黏性增加二、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞主要是指淋巴细胞和单核细胞。PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。细胞种类密度红细胞1.093白细胞1.092淋巴细胞和单核细胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各类血细胞密度常用的分离液：Ficoll液和Percoll液尤以密度为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll液）最常用。（一）Ficoll分离法注意：温度以20℃最适宜，超过25℃影响细胞得率（二）Percoll分层液法连续密度梯度分离液（Percoll液+PBS，离心）加入PBMC悬液或抗凝全血1000×g离心20min结果示意图三、淋巴细胞的纯化及亚群的分离采用Ficoll和Percoll分离法获得的细胞悬液成分仍然较为复杂、均一性不佳。通常需要进一步分离纯化淋巴细胞及其亚群。分离原理主要基于细胞的表面标志和功能等性质。淋巴细胞及其亚类的分离纯化是免疫学检验与研究的重要基础技术。（一）淋巴细胞的纯化去除红细胞：低渗裂解法、氯化铵裂解法。去除血小板：多次洗涤离心法、胎牛血清梯度离心法。去除单核细胞：黏附法、羧基铁吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴细胞的分离E花环沉降法该法简便易行，主要用于T细胞的分离PBMC悬液与SRBC混合Ficoll法密度梯度离心收集管底细胞并低渗裂解（二）淋巴细胞的分离尼龙棉分离法该法简单快速，可分离T细胞和B细胞PBMC悬液加入尼龙棉柱37℃中静置1～2小时预热的含小牛血清培养液洗脱获得T细胞冷培养液边冲洗边挤压获得B细胞（二）淋巴细胞的分离免疫磁珠分离法（二）淋巴细胞的分离流式细胞术分离法该法快速、细胞纯度和获得率高，可分离各种淋巴细胞及其亚群。四、吞噬细胞的分离吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中性粒细胞。分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。（一）单核细胞的分离Percoll密度梯度分离法流式细胞术分离法（常用方法）免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法）黏附法黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除单核细胞。（二）巨噬细胞的分离斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）

操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）

操作要点：少量液体石蜡注入动物腹腔内，3~4天后冲洗出腹腔渗出液（70%~80%为巨噬细胞）。（三）中性粒细胞的分离右旋糖酐沉降法：

操作要点：抗凝静脉血与6%右旋糖酐溶液按比例混合，室温条件垂直静置一定时间后，红细胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白细胞沉降速度慢位于上层，获取上层细胞。第二节淋巴细胞数量及功能检测许多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴细胞数量和功能变化。数量检测：根据淋巴细胞及其亚群的表面标志。功能测定：包括体内试验和体外试验。一、T细胞数量及功能检测（一）T细胞的数量检测根据T细胞表面CD分子检测：（1）间接荧光免疫法（2）免疫组织化学法：①酶标（ABC法、APAAP法）②金标法（即IGSS法）（二）T细胞功能检测T细胞增殖试验：形态学法、3H-TdR掺入法、MTT法CTL介导的细胞毒试验：51Cr释放法抗原特异性T细胞定量检测：MHC-抗原肽四聚体技术淋巴细胞内细胞因子检测：流式细胞术体内试验：结核菌素试验、PHA皮肤试验PBMCPHA5％CO2、

37℃培养72h细胞涂片染色显微镜检查该法简便易行、容易在基层推广，但主观因素影响大。形态学法T细胞增殖试验未转化淋巴细胞转化的淋巴母细胞转化率（％）＝转化的淋巴细胞数计数的淋巴细胞总数X100％培养液3H-TdRPHA淋巴细胞抗凝全血分离液离心过滤测量放射性3H-TdR掺入法灵敏度高客观性好原理：外周血T细胞

PHA发生增殖

MTT含蓝色甲颗粒的T细胞

MTT

PHA有机溶剂测吸光度（A）值

计算SI判定细胞增殖结果(SI≧2具有意义)MTT法操作简便无放射污染51Cr释放法淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线CTL介导的细胞毒试验淋巴细胞内细胞因子检测实验原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制剂如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪测定淋巴细胞内的细胞因子种类，确定Th1/Th2细胞的百分率。分泌的细胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的细胞因子二、B细胞数量及功能检测（一）B细胞数量检测根据B细胞表面标志进行检测：（1）mIg的检测：免疫荧光、免疫组化（2）

CD分子的检测：检测CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠红细胞受体的检测：花环试验（二）B细胞功能检测B细胞增殖试验：3H-TdR掺入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黄色葡萄球菌菌体或抗IgM抗体）B细胞抗体产生能力检测：溶血空斑试验、ELISPOT经典溶血空斑试验1.SRBC致敏的B细胞与SRBC在凝胶介质中混匀；2.抗体形成细胞(Antibodyformingcell,AFC)周围的SRBC与AFC产生的抗体结合而被致敏；3.加入豚鼠新鲜补体，致敏SRBC激活补体而溶解，在AFC周围出现肉眼可见的溶血空斑；4.计算溶血空斑的数目。溶血空斑试验酶联免疫斑点试验抗体产生B细胞抗原包被酶联抗抗体凝胶底物显色可在单细胞水平上检测B产生抗体和T细胞分泌细胞因子三、NK细胞数量及功能检测（一）NK细胞数量检测根据NK细胞表面标志进行检测：

CD分子的检测：检测CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK细胞功能检测形态学法酶释法：LDH释放法荧光法：时间分辨荧光免疫分析法放射性核素释放法：51Cr释放法、125I-UdR释放法流式细胞术：PI染色NK靶细胞检测荧光强度、cpm等K562细胞为人NK细胞杀伤功能检测的常用靶细胞第三节吞噬细胞功能检测一、中性粒细胞功能检测趋化功能检测：体内法（也称皮肤窗口法）体外法（滤膜渗透法/

Boyden小室法、琼脂糖平板法）吞噬功能检测：（吞噬金黄色葡萄球菌或白色念珠菌）杀伤功能检测：

溶菌法、硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验体内实验法--皮肤窗口法在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3小时后开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。（一）中性粒细胞趋化功能检测体外法--Boyden小室法Boyden小室体外法--琼脂糖平板法原理及技术要点

在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向右孔的移动距离B，计算趋化指数。趋化指数越大运动能力越强将细胞悬液与金黄色葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合，温育后涂片、固定和染色。在油镜下观察中性粒细胞对细菌的吞噬情况，计数100个细胞中吞噬和未吞噬细菌的中性粒细胞数，并记录吞噬的细菌数。（二）中性粒细胞吞噬功能检测（三）中性粒细胞杀伤功能检测硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验

方法：1.抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），温育25min；2.推片染色、镜检（含甲臜颗粒的中性粒细胞）。正常值：NBT阳性细胞率应7%~15%二、巨噬细胞功能检测炭粒廓清试验：主要用于动物实验吞噬功能检测：（吞噬鸡红细胞或白假丝酵母等）促凝血活性测定：正常小鼠肝中库普弗细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。主要用于动物实验（一）炭粒廓清试验（二）巨噬细胞吞噬功能检测巨噬细胞鸡红细胞或白假丝酵母＋孵育涂片染色镜检计算吞噬率和吞噬指数谢谢！第十五章流式细胞术免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库流式细胞术流式细胞术概念以流式细胞仪作为检测工具的高科学技术，借助单克隆抗体技术和荧光染料标记技术，对悬液中的单细胞或其他生物粒子进行高速、逐一的细胞定量分析和分选。流式细胞术的检测原理免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库流式细胞术的检测原理流式细胞仪的基本结构流式细胞仪有四个主要构成系统：液流系统、光学系统、电子系统、分选系统。流式细胞术的检测原理流式细胞仪的基本机构流式细胞仪有四个主要构成系统：液流系统、光学系统、电子系统、分选系统。流式细胞术的检测原理液流系统由流动室与液流驱动系统构成，是流式细胞仪的核心元件。流动室由样品管、鞘液和喷嘴等组成，分析时，鞘液包裹着细胞样品在气体正压的驱动下一同进入细胞流动室。流式细胞术的检测原理光学系统流式细胞仪的光学系统由激光光源、分色反光镜、光速形成器、透镜组和光电倍增管组成。流式细胞术的检测原理数据处理系统由计算机及相应的软件组成，是实验数据分析、存储、显示的重要组件。流式细胞仪的数据参数主要包括前向散射光、侧向散射光和荧光。流式细胞术的检测原理前向散射光（forwardscatter，FS）激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度（0.5°-10°）向前方散射的讯号。FS由位于激光束正前方的检测器收集，其强度与细胞的大小有关。对于同一细胞群体，FS信号的强弱与细胞体积大小呈正比。因此，FS主要用于检测细胞或其他颗粒的表面属性。流式细胞术的检测原理侧向散射光（sidescatter，SS）激光束照射细胞时，光以90°散射的信号。由位于激光束90º方向的检测器所收集，其信号主要由细胞内部的颗粒性成分对光发生折射而产生，反映细胞或颗粒内部结构的复杂程度、表面的光滑程度。SS信号的强弱与细胞内颗粒结构呈正比。流式细胞术的检测原理细胞分析的原理将待测样本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染色后，在气体压力推动下进入流动室。在流动室内被鞘液包绕形成单列细胞液柱，与水平方向的激光光束垂直相交。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次经过流式细胞仪的检测区，被荧光染料染色的细胞受到激光照射后发出荧光，同时，混合细胞群根据细胞大小和细胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。流式细胞术的检测原理细胞分选的原理当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱被分隔成一连串均匀的液滴，当含有满足设定分选条件细胞的液滴通过检测区时，脉冲发生器产生充电脉冲，使被选定的细胞液滴带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的液滴及不含细胞的空白液滴不被充电而不带有电荷。带电细胞液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其他液体则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。流式细胞术的技术特点流式细胞术的技术特点①测量速度快。②多参数分析。③灵敏度高。④精度高，分辨率高。⑤分选细胞的纯度可达到99%以上。⑥保持细胞、细胞器和微粒结构及功能不被破坏。流式细胞术的关键技术免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库FCM单细胞样本的制备样品类型外周血和骨髓标本培养细胞新鲜实体组织石蜡包埋组织脱落细胞FCM样本的荧光染色最常用的染料异硫氰基荧光素和藻红蛋白碘化丙啶藻红蛋白-得克萨斯红罗丹明FCM样本的荧光染色免疫荧光染色直接免疫荧光染色间接免疫荧光染色FCM的检测分析方法免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库FCM的检测分析方法单参数直方图单参数直方图是一维数据中常用的图形，可用于定性、定量资料的分析，反映相同荧光或散射光强度的颗粒的相对数量。单参数直方图仅表示一个测量参数与细胞数量之间的分布关系，不能显示两个独立的参数与细胞之间的关系。FCM的检测分析方法双参数散点图双参数散点图是一种细胞数与双测量参数的图形，X轴和Y轴分别代表与细胞有关的两个独立参数，根据这两种参数就可以确定细胞在双参数图上的表达位置。FCM的检测分析方法三参数直方图三参数直方图的三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数。任意在如FSC、SSC、FL1、FL2、FL3或FL4等参数中选择3个参数为X、Y、Z轴，构成一个三维图。在三维空间中每一群细胞各处于独立的空间位置，因此对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难。FCM的检测分析方法多参数综合分析多参数数据可每两个数据组成一对，用直方图、散点图、等高图或假三维图等进行分析。门（gate）和区域（region）的设置是多参数分析的基础。通过多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计各种细胞群体的数量或百分比以及平均荧光强度等，分析细胞的多种生物学特性。FCM的临床应用免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库FCM的临床应用淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞亚群分析淋巴细胞功能分析FCM的临床应用白血病免疫表型分析是研究白血病分化抗原和白血病分类诊断的重要手段，即利用单克隆抗体（McAb）检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原，分析其表现型，以了解白血病细胞的分类和分期。FCM的临床应用艾滋病的诊断与治疗流式细胞术是AIDS免疫功能检测的重要手段，它可以实现CD4+T淋巴细胞的绝对计数，对于HIV感染的人群定期监测CD4+T细胞的绝对数可以了解他们的免疫状态，已成为临床上诊断AIDS和进行疗效评估不可或缺的重要指标。FCM的临床应用免疫性血液病诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症免疫性血小板疾病和中性粒细胞减少症FCM的临床应用自身免疫性疾病与HLA表型分析自身免疫性疾病与某些类型的人类白细胞抗原（Humanleukocyteantigen,HLA）异常表达有关。如强直性脊柱炎，其外周的HLA-B27的表达程度与疾病的发生有很高的相关性。用流式细胞术测定淋巴细胞表面HLA-B27的表达，操作简便，结果稳定，重复性好。FCM的临床应用临床肿瘤学与移植免疫中的应用FCM可进行细胞周期分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡，从而获得组织形态学方法难以得到的信息，可为肿瘤的临床诊断、治疗和预防提供帮助。HLA组织配型，流式细胞交叉配型技术较传统应用的补体依赖淋巴细胞毒试验更加敏感、特异，且操作简便。谢谢！第十六章感染性疾病的免疫学检验免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库感染性疾病感染性疾病概念感染性疾病（Infectiousdiseases）指致病微生物引起炎症或器官功能障碍的症状。当病原微生物作为抗原入侵机体，在导致机体发生感染的同时，亦可诱导机体建立对微生物感染的免疫，以维持机体生理功能的平衡与稳定。固有免疫免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库免疫应答免疫应答分类根据免疫应答识别的特点、获得形式以及效应机制，可分为适应性免疫（adaptiveimmunity）和固有免疫（innateimmunity）。固有免疫固有免疫概念固有免疫亦称天然免疫或非特异性免疫，是人类在长期的种系发育和进化过程中，逐渐建立起来的一系列防御病原体等抗原的功能，构成了机体抵御病原生物入侵的第一道防线。微课：固有免疫应答的概念、组成、特点和机制固有免疫固有免疫的组成固有免疫的屏障结构屏障结构组成（1）物理屏障作用（2）化学屏障作用（3）生物学屏障作用

1、皮肤黏膜屏障固有免疫的屏障结构屏障结构组成功能：对中枢神经系统产生保护作用

2、血脑屏障固有免疫的屏障结构屏障结构组成功能：保护胎儿免遭感染、使之正常发育

3、血胎屏障固有免疫的效应细胞吞噬细胞吞噬细胞主要包括中性粒细胞（neutrophil）和单核-巨噬细胞（mononuclearphagocyte）两类。

固有免疫的效应细胞NK细胞NK细胞表面表达IgGFc受体，也可借助ADCC作用杀伤靶细胞。

固有免疫的效应细胞γδT细胞可直接识别某些完整的多肽抗原，是皮肤黏膜局部参与早期抗感染免疫的主要效应细胞，也具有非特异性杀瘤作用

固有免疫的效应细胞B1细胞B1细胞主要分布于胸腔、腹腔和肠壁固有层中。在机体早期抗感染免疫和维持自稳中具有重要作用。

固有免疫的效应细胞肥大细胞可直接识别某些完整的多肽抗原，是皮肤黏膜局部参与早期抗感染免疫的主要效应细胞，也具有非特异性杀瘤作用固有免疫的效应分子1、补体（1）细胞溶解作用（2）趋化和促炎症发生作用。在机体早期抗感染免疫中具有十分重要的意义固有免疫的效应分子2、细胞因子病原体感染机体后，可刺激免疫细胞和感染的组织细胞产生多种细胞因子，引起炎症反应，产生抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。固有免疫的效应分子3、溶菌酶溶菌酶能够裂解G+菌细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁的重要组分肽聚糖破坏，从而导致细菌溶解、破坏。固有免疫的效应分子4、乙型溶素乙型溶素可作用于G+菌细胞膜，产生非酶性破坏效应，但对G-菌无效。固有免疫的效应分子5、C-反应蛋白CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的冰原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。固有免疫的效应分子固有免疫的应答机制以吞噬细胞为例（1）接触病原菌（2）吞入病原菌（3）杀死和破坏病原菌视频：吞噬细胞吞噬细菌的过程固有免疫的应答机制接触病原菌巨噬细胞能表达多种模式识别受体（PAMP），参与对病原体的吞噬和杀伤作用。固有免疫的应答机制吞入病原菌吞噬细胞与细菌接触部位的细胞膜内陷，伸出伪足将细菌摄入，形成由部分细胞膜包绕的吞噬体。固有免疫的应答机制杀死和破坏病原菌1.氧依赖性途径：该途径主要效应分子是反应性氧中间物和反应性氮中间物。固有免疫的应答机制杀死和破坏病原菌2.氧非依赖途径：指无需氧分子参与的杀菌作用。主要通过：酸性环境、溶菌酶、防御素。固有免疫的生物学意义生物学意义

（1）抗感染作用（2）抗肿瘤作用和移植排斥反应（3）参与和促进炎症反应作用（4）参与适应性免疫应答人工抗感染免疫免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库抗感染免疫抗感染免疫概念抗感染免疫（anti-infectionimmunity）是机体对入侵病原体的防御性免疫，是机体抵御和清除病原微生物及其有害物质的一种生理功能。人工主动免疫人工主动免疫概念人工主动免疫（artificialactiveimmunization）是用人工方法给机体输入抗原，如疫苗、类毒素等，刺激机体产生相应免疫效应的方法。人工主动免疫人工主动免疫制剂1、死疫苗（killedvaccine）又称灭活疫苗，是用理化方法将致病微生物杀死而制成的疫苗。只激发体液免疫；全身和局部不良反应明显；稳定性好，易于保存。人工主动免疫人工主动免疫制剂2、活疫苗（livingvaccine）又称减毒疫苗，是通过自然筛选或人工诱变为弱毒或无毒的活微生物而制成的疫苗。产生体液免疫和细胞免疫；一般只需接种一次，用量小，不良反应轻，免疫效果持久；稳定性差，不易保存。人工主动免疫人工主动免疫制剂3、类毒素（toxoid）细菌的外毒素经0.3%~0.4%甲醛处理后失去毒性，仍保留免疫原性的制剂成为类毒素；接种后可诱导机体产生抗外毒素抗体，称为抗毒素。人工主动免疫人工主动免疫制剂4、新型疫苗（1）亚单位疫苗（subunitvaccine）（2）合成疫苗（conjugatevaccine）（3）基因工程疫苗（geneticallyengineeringvaccine）人工被动免疫人工被动免疫概念人工被动免疫（artificialpassiveimmunization）是用人工方法给机体直接输入抗体，使机体获得相应免疫力的方法。人工被动免疫人工被动免疫制剂1、抗毒素是用类毒素多次注射给马而产生的抗外毒素抗体，采集马血清浓缩纯化而制成。抗毒素主要用于外毒素所致疾病的治疗和紧急预防。人工被动免疫人工被动免疫制剂2、丙种球蛋白按制剂来源分为胎盘丙种球蛋白（取自健康产妇的胎盘血，主要含IgG类抗体）和血浆丙种球蛋白（取自正常人血浆，主要含IgG、IgM等抗体）。人工被动免疫人工被动免疫制剂3、特异性免疫球蛋白如抗乙肝免疫球蛋白、抗狂犬免疫血清、抗蛇毒免疫血清等特异性免疫球蛋白，用于紧急预防和治疗相应的传染病。计划免疫计划免疫概念计划免疫（planedimmunization）是根据某些传染病疫情监测和人群免疫状况分析，按照国家规定的免疫程序，将有关疫苗有计划地对人群进行接种，使人体获得对这些传染病的免疫力，从而达到控制、消灭相应传染病的目的。计划免疫疫苗接种效果监测检测疫苗诱导的体液免疫应答评价主要是评价疫苗诱导机体产生的特异性抗体反应。检测方法包括体内检测和体外检测。体液免疫应答监测疫苗接种效果监测细胞免疫应答监测疫苗诱导的细胞免疫应答评价包括体内试验和体外试验，主要检测T细胞活化情况。有关检测抗体的感染诊断试验免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库不同病原体感染抗体产生的特点链球菌感染的免疫检测（ASO）链球菌溶血素“O”是A群链球菌的代谢产物之一，它是一种具有酶活性的蛋白质。通过测定血清中ASO水平，有利于A群链球菌感染的诊断。过胶乳凝集试验测定血清中的ASO抗体效价。不同病原体感染抗体产生的特点伤寒沙门菌感染的免疫检测（肥达反应）肥达反应是检查患者是否被伤寒或副伤寒杆菌感染的一种检测方法，常用于伤寒、副伤寒的辅助诊断。肥达反应是试管凝集反应。不同病原体感染抗体产生的特点结核分枝杆菌感染的免疫检测结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来测定人体对结核杆菌是否有变态反应的一种试验。结核菌素试验常采用芒图（Mantoux）法。不同病原体感染抗体产生的特点甲型肝炎病毒抗体的检测甲型肝炎的实验室诊断主要依赖对血清中特异性抗体的检测。通常采用ELISA和化学发光技术对HAVIgG及IgM抗体进行检测。不同病原体感染抗体产生的特点乙型肝炎病毒抗体的检测1.乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）是一种保护性抗体，是机体感染或接种乙肝疫苗的标志。不同病原体感染抗体产生的特点乙型肝炎病毒抗体的检测2.乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）多出现于急性肝炎恢复期的患者中，比抗-HBs转阳要早，常在HBsAg即将消失或已经消失时检出。不同病原体感染抗体产生的特点乙型肝炎病毒抗体的检测3.乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBcIgM和抗-HBcIgG）抗-HBcIgM是早期HBV感染的特异性血清学标志，这对于急性乙肝诊断很有意义。抗-HBcIgG出现较晚，不是保护性抗体，检测抗-HBcIgG有流行病学调查意义。不同病原体感染抗体产生的特点丙型肝炎病毒抗体的检测丙型肝炎病毒感染的实验室检查主要包括免疫学及分子生物学检测，针对特异性抗体HCVIgG和HCVIgM的免疫学检测是临床常用的诊断方法，常用ELISA法进行检测。不同病原体感染抗体产生的特点梅毒螺旋体感染的免疫学检测1.非梅毒螺旋体抗原血清学试验：是用正常牛心肌的心磷脂（cardiolipin）作为抗原，检测病人血清中的反应素。不同病原体感染抗体产生的特点梅毒螺旋体感染的免疫学检测2.梅毒螺旋体抗原血清学试验：抗原为梅毒螺旋体，以检测血清中的特异性抗体，该试验特异性高，目前常用的方法有梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）、梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）。不同病原体感染抗体产生的特点人获得性免疫缺陷病毒感染的免疫检测血清中HIV抗体是判断HIV感染的间接指标。根据其主要的适用范围，可将现有HIV抗体检测方法分为筛检试验和确证试验。筛检试验主要用ELISA方法、化学发光法和免疫层析方法；确证试验包括免疫印迹检测法（WesternBlot，简称WB法）；放射免疫沉淀法（RIP）。不同病原体感染抗体产生的特点TORCH检测优生四项（TORCH）指可导致先天性宫内感染及围生期感染的病原体，它是一组病原生物的英文名称缩写。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测弓形虫抗体IgG、IgM（TOX-IgG、TOX-IgM）和循环抗原。检测抗体诊断感染的应用评价ASO评价A群链球菌感染后1周，ASO即开始升高，4~6周可达高峰，并能持续数月，当感染减退时，ASO值下降并在6个月内回到正常值，如果ASO值不下降，提示可能存在复发性感染或慢性感染。检测抗体诊断感染的应用评价肥达反应评价机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会在体内产生相应抗体，即O抗体，H抗体，伤寒抗体常在病后一周左右出现，第3~4周阳性率最高，并可持续数月。检测抗体诊断感染的应用评价结核菌素试验评价阳性反应表明机体对结核杆菌有变态反应，过去曾感染过结核，但不表示患病，因接种过卡介苗的人也呈阳性反应。强阳性反应则表明可能有活动性感染，应进一步检查是否有结核病。结核菌素试验可为接种卡介苗及测定免疫效果提供依据。检测抗体诊断感染的应用评价梅毒螺旋体的血清学试验评价采用密螺旋体抗原血清学试验，如ELISA和TPPA作为筛查试验。如怀疑一期梅毒，可进行特异性梅毒螺旋体IgM血清学试验，如有必要，可在1~2周后重复检测。检测抗体诊断感染的应用评价艾滋病病毒抗体检测评价筛选试验敏感性高，但特异性不高，故有假阳性；所以筛选试验阳性时需用确诊试验证实。确诊试验阳性，特别是RT-PCR法检测HIV-RNA阳性，对肯定诊断和早期诊断颇有价值。有关检测抗原的感染诊断试验免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库检测抗原的感染诊断试验轮状病毒感染的免疫检测轮状病毒（rotavirus，RV）是婴幼儿秋冬腹泻的主要病原菌，常导致水电解质酸碱平衡紊乱。轮状病毒抗原的检测是人类轮状病毒感染的特异诊断。检测抗原的感染诊断试验 乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清HBsAg的检测可采用ELISA、固相放射免疫法等方法，用于乙型肝炎病毒感染的筛选和普查。检测抗原的感染诊断试验 乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）多存在于HBsAg阳性的标本中，很少有HBeAg单独阳性者。HBeAg阳性是乙肝传染性的标志，在急性乙型肝炎早期常有HBeAg的检出。HBeAg阳性尚和HBVDNA复制、肝脏损害程度相关。检测抗原的感染诊断试验 乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）能反映血清中Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制，并可与其他的HBV血清标志物起互相配合和补充的作用，但在血清中难以检测。检测抗原的感染诊断试验谢谢！第十七章超敏反应性疾病免疫学检验免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库超敏反应性疾病免疫学检验目录/Contents01020304过敏原皮肤实验血清IgE检测抗血细胞抗体的检测第四节循环免疫复合物检测05第五节药物过敏筛选试验超敏反应性疾病免疫学检验超敏反应（hypersensitivityreaction）：

又称变态反应，是机体再次受到相同抗原刺激后发生的一种异常或病理性的免疫应答，这种免疫应答会使机体生理功能紊乱或组织细胞损伤，引起一系列疾病。引起超敏反应的抗原称为变应原（allergen），此类疾病即为超敏反应性疾病。课堂复习提问超敏反应分为几型？它们的特点分别是什么？超敏反应I型：速发型II型：细胞毒型或细胞溶解型III型：中等大小免疫复合物型IV型：迟发性病案讨论

刘某，男，7岁，因“频繁呕吐半天伴腹痛”就诊。发病前两小时患儿进食海虾3只，而后出现呕吐，为清水样，量中等。伴有腹痛，为脐周、中上腹阵发性疼痛。无发热、无腹泻、无皮疹。

该患儿哮喘性支气管炎病史，3岁时喘息发作过1次，给予普米克（糖皮质激素类药）、喘康速（β2肾上腺素受体激动剂）吸入治疗，并服用开瑞坦（抗组胺药），以后未再发作。以往曾有进食海鲜史。患儿母亲和外祖父有类似食物过敏史。

超敏反应病案讨论

查体：神清，双侧腕关节、肘关节处可见湿疹，双下肢未见异常，心肺正常，腹平软，脐周、中上腹压痛（+），反跳痛（-），无肌紧张。颈软，神经系统（-）。实验室检查：血常规：嗜酸性粒细胞百分比为12%(正常值0.5～5%)，其他指标正常。血清IgE为1350IU/ml(正常值0～100IU/ml)。超敏反应1.该病人的主要诊断是什么？2.该病人可以通过何种检测辅助诊断？过敏原皮肤试验免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库过敏原皮肤试验皮肤试验的原理

皮肤试验(skin

test)简称皮试,是在人体皮肤上进行的体内免疫学试验。通过少量抗原的经皮进入人体,观察局部皮肤反应判断。如果试验抗原为变应原,则皮肤中结合有IgE的肥大细胞或致敏T细胞就会与其结合,引发即刻型或迟发型皮肤超敏反应。过敏原皮肤试验皮肤试验的原理

皮肤试验主要用于检测I型和IV型超敏反应。此外,试验抗原也可从注射部位进入微血管,观察是否与循环中相,抗体结合,形成免疫复合物沉积,激活补体在局部皮肤引起炎症,检测Ⅲ型超敏反应。目前临床常见的检测方式主要为点刺实验和斑贴试验。（一）I型超敏反应皮肤试验原理

当变应原通过皮肤挑刺、划痕、皮内注射等方法进入致敏者皮肤,与吸附在肥大细胞或(和)嗜碱性粒细胞上的特异IgE高变区结合,导致肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放生物活性介质。在20~30分钟内局部皮肤出现红晕、红斑、风团以及瘙痒感,数小时后消失。出现此现象者判断为皮试阳性,即对该变应原过敏;未出现红晕红斑、风团者为阴性,即对该变应原不过敏。皮肤试验的原理（二）IV型超敏反应皮肤试验原理

用皮内注射、皮肤斑贴等方法使变应原进入已致敏机体,体内致敏的T细胞再次接触到变应原后,释放多种细胞因子,造成局部以单核细胞和淋巴细胞浸润为主的炎症反应。24-48小时后局部出现红肿、硬结或水泡,以此来判断变应原是否引起机体IV型超敏反应或机体的细胞免疫功能状态。皮肤试验的原理皮肤实验的方法

皮肤实验最常用的部位是前臂曲侧、上臂伸侧或背部，此处皮肤较多树突状细胞且光滑细腻，适合实验操作和结果观察。左右两臂应一侧做试验，一侧做对照。（一）皮内试验（intradermaltest）

将实验抗原与对照液各0.01-0.03ml分别用皮试针头注入皮内，使局部形成圆形皮丘，如同时实验多种抗原时，相互间隔至少为4cm，以免强烈反应时互相混淆结果。

皮肤实验的方法（一）皮内试验（intradermaltest）

皮内试验是最常用的皮肤试验,测试剂量控制严格,结果较可靠,有助于准确判断变应原，应用范围广。

几乎各类抗原及各型反应都可用皮内试验进行测定，只是不同类型的反应观察结果的时间和判定标准有所不同。皮肤实验的方法（一）皮内试验（intradermaltest）

当高可疑性抗原出现阴性结果时，可逐渐加大抗原浓度进行重复试验，须注意皮内试验敏感性相对其他皮肤试验高，所用抗原浓度应严格控制，以免出现严重反应。皮肤实验的方法（一）皮内试验（intradermaltest）皮肤实验的方法（二）点刺试验（pricktest）

又称挑刺试验或刺痕试验，将抗原与对照液分别滴于试验部位皮肤表面，用针尖穿过液滴在皮肤上以刺破皮肤不出血为度进行点刺，1分钟后拭去抗原液，15分钟后观察结果，如同时试验多种抗原时，应注意抗原间不能交叉混合。皮肤实验的方法（二）点刺试验（pricktest）皮肤实验的方法（三）斑贴试验（patchtest）

取1cm2大小四层纱布，浸沾致敏物溶液，贴敷于受检者前臂内侧或背部正常皮肤上。上面盖以玻璃纸或蜡纸，再用纱布固定。24~72h观察结果。皮肤实验的方法（三）斑贴试验（patchtest）皮肤实验的方法（一）结果判读

I型超敏反应（速发型）的结果判定应在皮试后的15-30分钟进行，可参照本表，皮内试验的阳性反应以风团为主，点刺试验的阳性反应以红晕为主。临床意义（一）结果判读

IV型超敏反应（迟发型）结果判定在48-72小时进行，皮内试验阳性结果以红肿和硬结为主。

斑贴试验一般于48小时后打开斑试器，并等待30分钟后第一次读取结果，并在第三天或第四天再次读取结果。试验的阳性结果以红肿和水疱为主。临床意义（一）结果判读临床意义（二）结果分析及注意事项

因皮肤试验影响因素较多，结果判定无法量化，可能会出现假阴性和假阳性情况，一般常出现的假阴性可能由以下情况引起：1.皮试液的浓度过低或失效。2.老年患者或过敏性休克或哮喘大发作之后。3.皮试前用过抗组胺药或免疫抑制剂。4.操作不当将皮试液注入皮下或注入量过少等。临床意义（二）结果分析及注意事项

而假阳性则常见于以下情况：1.皮试液含有非特异性刺激物。2.患者患有皮肤划痕征。3.操作手法过重。4.注入量较大或浓度过高。5.少量空气混入等。临床意义（三）临床意义

皮肤试验属于体内免疫学试验,直接在人体上测试，虽然较易受到各种因素的干扰，但是能反映机体目前实际免疫状态，加上其操作简单，结果可信性高，目前被临床广泛应用，常用于以下方面：1.寻找过敏原2.预防药物或疫苗过敏3.评估机体免疫细胞功能临床意义课堂提问青霉素皮试属于什么试验？为什么我们接种疫苗后需要在接种室等待30分钟左右点刺试验1.点刺试验2.I型超敏反应（速发型）的结果判定应在皮试后的15-30分钟进行血清IgE检测免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库血清IgE检测一、血清总IgE检测血清总IgE是血清中各类IgE含量的总和，正常情况下血清总IgE的含量极低，仅在ng/ml水平，因此临床上一般选用敏感度较高的方法放射免疫测定法、酶联免疫测定法及化学发光法进行检测。血清总IgE检测（一）放射免疫吸附试验（RIST）

将待测血清与标准量放射标记的IgE混合，再与结合于不溶性载体上的抗IgE抗体反应，经适度的孵育和洗涤后，测定吸附于载体上的放射标记的IgE量，故又称固相放射免疫测定（SPRIA）。临床常用双抗体夹心法，多以滤纸为载体，将抗IgE抗体偶联到经溴化氟活化的滤纸上，使其与待检血清及IgE标准进行反应；洗涤后加入125I标记的抗人IgE，再经洗涤后测定滤纸片的放射活性，其测定值与标本中的IgE含量呈正相关。血清总IgE检测（二）酶联免疫测定法（ELISA）

测定血清IgE也可用双抗体夹心ELISA法(见第八章),该法方便、实用，敏感性、特异性均较好，而且无放射性核素污染，也不需要特殊仪器。血清总IgE检测（三）化学发光法

用化学发光物质标记抗IgE抗体,其与血清中IgE结合后,通过化学发光分析,计算出血清中IgE含量。此法敏感性、特异性均较好,并且自动化程度较高，为临床上常用方法。特异性IgE检测

特异性IgE是指能与某种过敏原特异性结合的IgE，因该抗体只能和相应的变应原结合，因此需要用纯化的变应原进行检测，常用的检测方法包括以下几种（一）放射变应原吸附试验（radioallergosorbenttest，RAST）（二）酶联免疫测定法（三）免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)（四）固相荧光免疫测定法此法操作简单，一次可检测多种特异性IgE，但反应体系单一，易互相影响。特异性IgE检测（一）放射变应原吸附试验（二）酶联免疫测定法（三）免疫印迹法（四）固相荧光免疫测定法此法因没有同位素污染，酶标抗体可长期保存。该法特异性强，敏感性高，影响因素少，但费用较高、花费时间长，易受血清IgG影响。本法敏感度高，特异性强，具备良好的溯源性，越来越广泛的被临床使用。临床意义（一）血清总IgE血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示（1IU=2.4ng）。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以至各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。临床意义（一）血清总IgE

成人血清IgE水平约在20～200IU/ml之间，一般认为大于333IU/ml（800ng/ml）时为异常升高。I型超敏反应性疾病，如哮喘、变应性鼻炎、特发性皮炎、湿疹、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、寄生虫感染、急慢性肝炎和IgE型多发性骨髓瘤均可使血清总IgE水平升高。因此在分析血清总IgE水平诊断I型超敏反应时，需要参考当地人群总IgE水平并排除相关疾病。（二）特异性IgE特异性IgE测定是体外检测变应原的重要手段。主要用于1型超敏反应的诊断。其试验的灵敏度及特异性都很高。根据sIgE含量可确定患者变应原种类,评价患者过敏状态、脱敏治疗的疗效,对哮喘的诊断和鉴别诊断有重要帮助。临床意义（二）特异性IgE

但单纯特异性IgE升高并不能诊断I型超敏反应性疾病，主要因为以下三点：1.sIgE阳性只说明对该过敏原已经致敏,而致敏与否还与机体免疫功能状态有关。2.sIgE阳性与现有疾病没有直接关系,而是过去致敏的过敏原。3.交叉反应。临床意义抗血细胞抗体检测免疫学检验技术职业教育医学检验技术专业教学资源库

机体产生的抗血细胞抗体是II型超敏反应的主要介质，其与血细胞结合后，可导致血细胞破坏，临床上引起贫血、粒细胞减少、血小板减少等。其大多属于不完全抗体，与相应抗原结合后不产生凝集现象。对不同的血细胞抗体，检测方法基本相同，现将抗球蛋白检测做简要介绍。抗血细胞抗体的检测

抗球蛋白的检测通常用抗球蛋白实验，即Coombs试验或称antiglobulinstest（AGT），其作为检测不完全抗体的经典方法，基本原理是利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异性抗体，使红细胞凝集。Coombs试验分为了直接法和间接法。抗球蛋白检测抗球蛋白检测（一）直接Coombs试验

用于直接检测红细胞表面的不完全抗体。患者体内若有抗红细胞抗原的不完全抗体存在，可与红细胞发生