化学品 液态粪肥中的厌氧转化试验 征求意见稿

1GB/TXXXXX—XXXX化学品液态粪肥中的厌氧转化试验本文件规定了化学品液态粪肥中厌氧转化试验的术语与定义、试验原理、受试物信息、参比物、方法描述、试验程序、质量保证与质量控制、数据和报告。本文件适用于测试和评估化学品在液态粪肥中的厌氧转化；用于测定化学品在液态粪肥作用下的转化率，以及转化产物的性质和生成率、降解率。本文件适用于不挥发或轻微挥发性物质（亨利定律常数<100Pa•m3/mol或<1*10-3atm•m3/mol）、水溶性或水中微溶、能被精确分析的所有化学品。本文件不适用于易挥发的化学品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21852化学品分配系数(正辛醇-水)高效液相色谱法试验GB/T21853化学品分配系数（正辛醇-水）摇瓶法试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T22052用液体蒸汽压力计测定液体的蒸汽压力和温度关系及初始分解温度的方法GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸汽压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸汽压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸汽压平衡法GB/T21851化学品批平衡法检测吸附/解吸附试验HJ1257-2022化学物质环境管理化学物质测试术语OECD化学品测试导则No.104蒸汽压OECD化学品测试导则No.112水中解离常数3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.150%衰减时间disappearanceordissipationtime50，DT50受试物浓度降低至初始浓度的50%时所需要的时间。3.290%衰减时间disappearanceordissipationtime90，DT90受试物浓度降低至初始浓度的90%时所需要的时间。2GB/TXXXXX—XXXX3.3流动试验flow-throughtest经水饱和的氮气以恒定流速通过粪肥培养系统的试验方法。3.4半静态测试semi-statictest在培养系统中，润湿的氮气在开始和整个测试过程中间歇地（例如一周一次）通过粪肥样品的试验方法。3.5粪肥manure尿液、粪便和水的混合物。3.6质量平衡massbalance在每个采样时间点，从测试系统中回收的最初添加的放射性物质的百分比。3.7矿化mineralization有机化合物的完全降解。在厌氧条件下可变为CH4、CO2和H2O。3.8不可提取残留物non-extractableresidues,NER指粪肥中提取后残留在基质中的化合物。3.9转化产物transformationproducts受试物经生物或非生物转化反应产生的所有物质，包含CO2、CH4和不可提取的残留物。4试验原理粪肥样品经受试物处理，并在受控的实验室条件下厌氧、恒温、避光培养。在适当的时间点，提取和分析粪肥样品中的母体物质和转化产物，分析经捕集装置收集的挥发性产物，定量测定CO2和CH4；如果需要，也可以测定更多的挥发性产物。若使用14C标记的受试物时，依据质量平衡，测定受试物的矿化速率，确定不可提取残留物的形成。5受试物信息未标记或标记的受试物可用于测量母体化学物质的消散速率。标记应位于分子最稳定的部分，14C放射性标记受试物是用于研究转化途径，定量分析CO2和CH4、不可提取残留物(NER)的产生，筛选和3GB/TXXXXX—XXXX量化转化产物以及建立质量平衡所必需的。为了跟踪活性部分，应在相应位置标记。对于复杂分子（例如，包含多个芳香基团）或多取代的分子，可能需在不同位置进行标记。使用13C、15N或2D（非交换性）等稳定同位素有助于通过各种光谱方法（例如质谱法或核磁共振光谱法）识别转化产物或表征不可提取残留物。受试物的纯度应至少为95%。5.1受试物信息包括：a）水中溶解度（GB/T21845）；b）有机溶剂中溶解度；c）蒸汽压（GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229和OECDNo.l04）和亨利常数；d）正辛醇/水分配系数（GB/T21852和GB/T21853e）水中的化学稳定性（水解GB/T21855f）解离常数pKa，如果分子易于质子化或去质子化（OECDNo.112g）吸附行为（GB/T21851）。5.2其他信息包括：a)受试物或转化产物对微生物的毒性数据，例如：根据OECDTG209、OECDTG216、OECDTG217或OECDTG224；b)用于定量和鉴定受试物及其转化产物的分析方法（包括提取和净化方法）。如果可获得标准品，应采用标准品通过光谱和色谱方法来表征和/或鉴定转化产物。若无标准品，可以尝试基于光谱技术（高分辨率质谱和核磁共振光谱）进行鉴定。6参比物测试中可以包含参比物，以确保试验设备的适用性和粪肥中的微生物活性。在测试条件下容易降解的物质可以作为参比物，例如水杨酸钠（CAS：54-21-7）或水杨酸（CAS：69-72-7）。7方法描述7.1仪器设备试验所用仪器设备如下：a）分析仪器，气相色谱仪（GC）、高效液相色谱仪（HPLC）等用于受试物及转化产物化学分析的仪器设备，以及包括用于分析放射性同位素示踪标记、非标记受试物的检测系统；b）用于鉴定的仪器，如质谱仪（MS）、拉曼光谱仪（RAM）高分辨质谱仪（HRMS）、核磁共振仪（NMR）等；c）液闪仪和用于氧化放射性物质的氧化器；d）离心机；e）提取装置（例如，冷冻萃取离心管，索氏萃取装置，加速溶剂提取装置）；f）浓缩装置（例如旋转蒸发仪g）水浴锅；h）机械混合装置（例如搅拌机、旋转混合机、手动混合机）。4GB/TXXXXX—XXXX7.2化学试剂试验所用化学试剂如下：a）NaOH（分析纯2mol/L，或者其他合适的碱性试剂（如KOH，乙醇胺b）Ba(OH)2（分析纯0.25mol/L；c）H2SO4（分析纯0.05mol/L；d）HCl（分析纯10%；e）有机溶剂（分析纯如丙酮、甲醇等；f）无机盐（分析纯例如KH2PO4（用作提取溶剂g）闪烁液。7.3试验装置在合适的测试系统中进行培养。半静态试验和流动试验培养装置的示例分别见附录B和附录C。对于无矿化或极低矿化的物质，可以使用流动试验系统或半静态试验系统。矿化度较高的物质，优先选择半静态试验系统。为确保厌氧条件，采用润湿氮气以50~200mL/min的流速间歇（对于半静态试验系统）或连续（对于流动试验系统）通过样品。填充了NaOH的捕集器（或其他合适的捕集溶液）用于吸收释放的CO2。可能形成的甲烷(CH4)积累在培养瓶中（半静态试验系统）或通过CO2捕集器（流动试验系统）后在燃烧管中燃烧生成CO2，最终被CO2捕集器吸收。通过测定Ba(OH)2沉淀的放射性，验证CO2捕集器中吸收的是14CO2，而不是来自挥发性脂肪酸(VFA)。根据受试物及其可能的转化产物，可能需要进一步的捕集器（例如乙二醇、硫酸）来收集挥发性有机化学物质。预试验可为受试物和转化产物的行为提供有价值的数据（例如，在某些情况下，受试物快速消散，须调整采样时间点；或消散很慢，需延长试验时间）。7.4粪肥7.4.1粪肥的选择用于测试的粪肥应从粪肥储存罐、预储存罐或粪池中采集。粪肥储存设施可在地上或地下，采样前的六个月内粪肥不应暴露于受试物或同一类别的化学物质。采样时需了解动物的数量、类型和年龄、饲料，以及动物的用药（例如兽药或饲料添加剂）、动物圈舍内的杀生剂或其他化学产品（例如消毒或防虫处理）的信息，若受试物用于农田时建议进行化学残留分析。粪肥中的转化研究应在相关生物（例如猪、牛）的粪肥中进行，不能从一个物种外推到另一个物种。每个物种至少应使用一种粪肥，若经采样证明粪肥基质参数不满足标准，仍应报告测定结果。7.4.2粪肥的采集、处理和贮存5GB/TXXXXX—XXXX猪和牛的粪肥采样：采集前须经粪肥罐中的设备或外部设备将粪肥在粪肥罐中至少混合均匀1h，以确保粪肥均质化。基于猪粪比牛粪更快地分离成不同状态，猪粪混合后应立即取样，牛粪可在取样前提前一天混合。可以使用如一个带大烧杯的长柄勺子从粪罐中收集粪肥，采样体积不超过容器的75%并密闭。因微生物持续产生气态产物，建议将带有发酵气闸的管连接到采样容器的出口。详细记录采样地点、采样程序（混合时间和持续时间）以及粪池的类型（例如地上/地下、覆盖/露天）和大小。粪肥的贮存：试验时最好采集新鲜的粪肥，若无法满足时也可将粪肥在4℃-20℃（最好在测试温度下）最长储存两个月。储存时应确保厌氧/产甲烷条件。7.4.3粪肥的性质表征粪肥参数见下表。表1用于表征粪肥的参数XXXXXX氮含量（N，mg/kg）X氮含量（NH-N，mg/kg）XXXXXXXXXXXXXXXX：例如DIN12879“CharakterisierungvonSchlämmen-Be：必须确保在整个测试期间氧化还原电位：例如DINEN12880“污泥表征-干残渣采样阶段后（即驯化开始、试验开始、试验期间和试验结束时）收集的数据必须根据调整后的粪肥干物质含量和湿重进行报告。应分析背景对照或空白样品，以排除粪肥中存在的受试物。6GB/TXXXXX—XXXX除干物质含量外，不得对采样的粪肥进行任何更改或调整。7.4.4粪肥干物质含量和均质化在驯化期开始之前，需确定粪肥的干物质含量，必要时可进行调节。牛粪和猪粪推荐的干物质含量分别为10±1%(w:w)和5±1%(w:w)。如果干物质含量低于推荐值，则可以离心（例如以740g离心10min）进行浓缩，但初始干物质含量必须应≥8%（牛）或≥3%（猪若不满足这些最低值则须收采集新鲜粪肥并用于测试。若干物质含量过高，可根据需要加水调节（去离子水，用氮气鼓泡30min）。在确定干物质含量和调整（如有必要）之前，应对粪肥进行均质化处理。猪粪/牛粪应在厌氧条件下进行均质化，以获得稳定的相态，例如将粪肥装入烧杯中缓慢通入氮气并用混合器/均质器（例如手动搅拌器）混合，使粪肥均质化；若缓慢混合（例如使用玻璃棒）将牛粪均质化时无需进行防止氧气干扰的额外措施。调整干物质含量后，再次将粪肥均质化（方法同上将50-100g样品（湿重）直接装入培养容器中用于驯化和转化试验。7.4.5粪肥驯化应在黑暗（首选）或漫射光下在测试温度下进行21±1d的驯化。如果使用半静态试验设备，则培养系统用氮气冲洗1h以保持厌氧条件，此后，通过阀门关闭培养系统；如果使用流动试验设备，则必须关闭培养设备，并以水饱和的氮气约50-200mL/min的恒定流率流过粪肥。7.5试验条件7.5.1试验温度和光照条件培养应在黑暗（首选）或漫射光下在受控温度(±2℃)下进行，该温度可以是场地温度或20℃的标准温度。其中场地温度可以是采样时样品的实际温度，也可以是采样点的平均场地温度。DTx值可以转换为与环境相关的温度。为了确定转化途径，可能须使用与环境相关的温度。注：如果在较低温度下无法识别转化产物，则可能还7.5.2厌氧培养条件牛粪和猪粪的转化试验应在与粪肥罐中观察到的相似的氧化还原条件下进行。猪粪和牛粪的典型氧化还原电位值范围为-230mV至-400mV，试验期间应测量并定期记录氧化还原电位，以确保整个试验过程中保持厌氧条件稳定，Eh不应超过-100mV。7.5.3非生物对照可设置无菌对照测定受试物的非生物转化。对于进行快速非生物转化的受试物，必须进行无菌对照。7GB/TXXXXX—XXXX无菌对照也可以提供转化过程的更多信息。粪肥经过消毒，用无菌受试物处理，烧瓶保持封闭。无菌对照的取样应根据取样时间表进行，取样时间点可以较少，但至少应在试验结束时对无菌对照进行取样。可通过至少两次高压灭菌来实现灭菌：将测试容器中的粪肥预热过夜（至少12h）至100℃,白天让容器冷却至室温。开始第一次高压灭菌循环（15min，121℃)并让测试容器再次冷却至室温过夜，以使细菌孢子萌发。然后开始第二次高压灭菌循环（15min，121℃)。此程序有助于灭活细菌孢子并防止起泡。也可以使用其他消灭生物活性的方法（例如添加毒物或伽马辐射）。7.5.4受试物的处理和添加受试物应根据特定物质的暴露情景以最大预期浓度投加到粪肥中，浓度单位通常为mg/kg，例如粪肥中的兽药。应报告使用特定受试物浓度的原因。如果该浓度不足以分析和鉴定转化产物，应增加浓度进行测试，但应避免过高的添加浓度对微生物造成毒性抑制。受试物应以水溶液形式或溶解在适当的水混溶性有机溶剂中加入，并应添加到相应培养容器中的驯化粪肥中，然后充分混合，同时保持厌氧条件。例如可通过在试验过程中连续通过样品的氮气流保持厌氧。使用移液器吸头将所需体积的贮备溶液添加到粪肥中，并使溶液均匀分布在粪肥中，因粪肥可能会粘在移液器吸头中，为避免损失移液器吸头仍留在粪肥中。也可使用其他方式实现受试物均匀分布（例如玻璃移液管、微升注射器）。用于添加的溶剂的总体积不应超过1%（按体积计）。7.5.5试验持续时间和采样试验持续时间将取决于母体受试物和转化产物的转化速率。标准试验时间为驯化期结束后的90d。在某些情况下，也可合理延长试验时间，理想情况下试验结束时受试物和转化产物的含量应低于加入量每次每组取两瓶试验样品。根据受试物的消散模型，转化产物的生成和消散模型（确定取样间隔时间例如0、1、3、7d；2、3周；1、2、3个月等）。除了添加受试物后直接取样外，至少应包括7个额外的取样点。动力学模型可能需要更多的采样时间点，以涵盖转化产物的形成和消散。预试验可能会为受试物和转化产物的行为提供有价值的信息。在某些情况下，可能会观察到受试物的快速消散，因此须调整相应的采样时间点。CO2和CH4是在厌氧条件下可能形成的挥发性转化产物。除了这些化合物，还可能形成其他挥发物（例如挥发性脂肪酸，VFA）。试验装置须满足：定量捕获以避免挥发物的任何损失并能够建立质量平衡，区分形成的CO2、CH4和其他挥发物。为此，至少在采样时间点移除用于测量矿化的捕集阱，并分别分析捕获的14CO2和其他产生的气体。首先，取出吸收阱，用新填料的捕集阱代替，并分析原吸收阱的放射性含量。此后，将在该特定采样点移除粪肥培养瓶并通过添加10mL的10%HCl进行处理，以去除可能溶解的CO2（或HCO3-/CO32-）。添加10mL的10%HCl后，再次关闭培养瓶，通入氮气至少8GB/TXXXXX—XXXX24h。此后，移出粪肥培养瓶并对样品进行清理、提取和分析。在酸化之前安装的CO2捕集器直接被移出，并对额外捕集的14CO2进行放射性计数。如果受试物或转化产物在酸化条件下不稳定，则应设置单独的培养瓶用于化学分析。有关采样流程的详细说明，请参见附录B（半静态系统）和附录C（流动试验系统）。7.6试验程序7.6.1质量平衡、分析方法的回收率、重复性和灵敏度对于非标记和有标记的受试物，应确定受试物分析方法的回收率和其他有效性标准（如重复性回收率应至少为70%至110%。这些有效性标准也适用于转化产物的分析方法。对于放射性标记的受试物，初始质量平衡应在90%-110%之间，试验期间每个重复的质量平衡应在85%-115%的范围内。用于受试物和转化产物的分析方法的检测限应至少为添加剂量的1%或至少0.01mg/kg湿重，以较低者为准。还应确定定量限。7.6.2测量和分析粪肥样品在取样后直接提取，除非可以证明样品储存不影响提取效率和分析检测。样品应用适当的溶剂提取，提取方法应确保母体物质和转化产物的回收率。应使用水性溶剂混合物以及酸和碱体系作为溶剂，以确保提取更多的极性母体物质和转化产物。可采用较多的提取方法，例如加速溶剂萃取（如ASE®,PLE）、回流、索氏等。当使用14C标记的受试物时，提取后剩余的残留物（不可提取的残留物）应通过燃烧进行量化，并应计算每个采样间隔的质量平衡。注：如果不能定量确定不可提取残留物（NER）的量，例如在非标记的测应确定并报告每次取样时受试物和转化产物的浓度。一般情况，在任意采样时间点，≥10%的放射性转化产物应被鉴定。一旦检测到≥5%的放射性，在试验期间转化产物浓度有所增加，则转化产物也应被鉴别。通常，鉴定是通过使用两种不同的系统对转化产物与已知标准品进行联合色谱分析或通过能够进行结构识别的技术（如质谱、核磁共振等）完成。在联合色谱分析的情况下，使用具有相同的固定相和两种不同的溶剂体系的色谱技术不足以验证转化产物的特性，应使用两种不同的、分析独立的系统，例如反相和正相薄层色谱（TLC）或TLC以及高效液相色谱（HPLC通过联合色谱分析进行鉴定。如果色谱分离具有合适的质量，则不需要通过光谱学进行额外的确认。还可以使用提供结构信息的方法获得明确的鉴定，如气相色谱/质谱（GC-MS）、液相色谱/质谱（LC-MS）、液相色谱/串联质谱（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR）。除非观察到不同的行为，否则通常不需要确定转化产物的立体化学。应采用适当的方法尽可能充分地阐明转化途径。9GB/TXXXXX—XXXX应特别注意不可提取残留物（NER因为粪肥是一个过渡区，即粪肥基质本身在扩散到土壤后会降解。因此，母体化学物质或转化产物被包留在粪肥基质中或与粪肥基质相关联时，若不能通过上述提取方法提取，很大可能会由于粪肥基质降解而释放。7.6.3试验数据的动力学评估必要时，评估动力学模型与测试数据的拟合效果。若需确定转换产物的DT50和DT90值时，可能需要更多的采样时间点。8质量保证与质量控制a）试验须在粪肥罐中氧化还原条件下进行，试验期间氧化还原电位（Eh）应≤-100mV。b）对于放射性标记的受试物，试验开始时的质量平衡应在90%到110%之间。在试验期间，每个重复的质量平衡应在85%-115%范围内。c）对于标记和未标记的受试物，分析方法回收率应达到70%-110%。9数据和报告9.1数据处理和试验结果评估应报告粪肥基质参数（如适用，基于湿重）。每个采样间隔的受试物、转化产物、挥发性物质、CO2和CH4以及不可提取的残留物（NER）的量应按初始用量的百分比给出，并以mg/kg粪肥（基于湿重）计。质量平衡应以每个采样间隔所占初始添加量的百分比给出。应分别报告每个平行试验组的数据和所有平行的算术平均值（参见附录D）。绘制基于非对数的受试物和转化产物浓度与时间的图。鉴别主要的转化产物，并绘制时间与浓度图，以显示其形成和消散的速度。试验期间任何时间出现的≥10%的添加剂量的转化产物。还应鉴别在所应用放射性的≥5%但在试验结束时尚未达到最大生成量的转化产物。尽可能通过数据与适当动力学模型拟合，确定受试物和转化产物的DT50和DT90值。DTx值应与所使用的模型以及拟合优度一起报告。9.2测试报告报告应包括：a）受试物和转化产物（如适用——通用名称，化学名称，CAS编号，结构式(当使用放射性标记时指明标记的位置)和相关的物理化学性质；——受试物纯度（杂质——标记受试物的纯度和放射活性，分析证书（如适用）。GB/TXXXXX—XXXXb）用于鉴别转化产物的标准物质：——用于表征和/或鉴定转化产物的标准品的化学名称和结构。c）分析测定：——粪肥基质参数的测定方法；——受试物和转化产物的定量和鉴定方法；——分析方法验证的结果，包括但不限于所使用分析方法的回收率、重复性、LOD和LOQ（以加入量的百分比和mg/kg表示——质量平衡；——提取过程。d）粪肥的测定：——采样点的详细信息（日期，位置，动物类型和数量，饲料，粪肥罐的类型和大小，取样前六个月内使用化学品的信息，例如杀生剂或兽药——粪肥取样日期和程序；——粪肥基质参数（pH值、有机质含量，氮含量，氧化还原电位，干物质含量，温度，湿重——粪肥储存的持续时间和储存条件（如果储存在实验室中）。e）试验条件：——试验日期；——受试物的添加量；——最大预期粪肥浓度的计算（包括理由——受试物添加使用的溶剂（如适用）和添加方法；——处理过的粪肥重量（鲜重——所用培养系统的描述；——氮气流速（仅适用于流动试验系统和半静态试验系统——温度；——粪肥的基质参数（pH值，氧化还原电位，干物质含量，粪肥湿重，温度——平行样个数和对照组个数，包括无菌对照。f）结果：——每个时间点的粪肥基质表征结果；——结果表以初始添加剂量的百分比表示，如适用，可用每个平行的mg/kg粪肥（基于湿重）表示和以下参数所有平行的平均值表示；——不可萃取残留物的放射性表征；——产生的二氧化碳和甲烷以及其他挥发性化学物质的量；GB/TXXXXX—XXXX——每个采样点的质量平衡；——受试物和转化产物的定量；——受试物的浓度（非对数）与时间的关系图，如适用，绘制主要转化产物浓度与时间的关系图；——受试物的DT50和DT90值，以及（如适用）主要转化产物的DT50和DT90值，包括用于拟合的动力学模型和程序；——无菌条件下的非生物转化；——受试物储存稳定性，当样品在化学分析之前储存时；——对受试物的转化动力学进行评估，如适用评估转化产物的转化动力学；——建议的转化路径，包括报告转化产物的结构式和转化产物的名称；——讨论和结果解释；——原始数据（例如，样品色谱图，转化率计算和用于鉴别转化产物的方法）。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）水杨酸的取样和分析测定除了下面描述的方法外，还可以使用其他适当的分析方法（例如GC-MS或LC-MS）。用80mL甲醇+1%三氟乙酸（TFA）提取50g湿粪肥样品一次，然后用50mL甲醇+1%TFA提取两次。提取时，将样品在水平摇床上震荡30min后离心（例如，以740g离心10min）。离心后，收集上清提取液，沉淀物进行下一步提取。整个过程重复两次。合并提取液，并通过放射性TLC（薄层色谱）进一步分析。在最后一个提取步骤之后，将沉淀物风干，对等分样品进行燃烧和放射测定，以提供有关不可提取残留物（NER）量的信息。除了所描述的提取之外，还可以使用加速溶剂萃取（ASE®,PLE）进行进一步提取。加速溶剂萃取(ASE®)，即在高压和高温下萃取（100℃,12000kPa，加热5min，然后静置10min使用与第一个提取步骤相同的溶剂混合物（80mL甲醇+1%TFA）。提取进行两次，但提取物不合并。由于未经进一步净化的提取物可能会影响HPLC的性能，从而导致宽峰，因此放射性TLC优于HPLC。建议使用以下TLC系统：a）固定相：硅胶KG60b）流动相：甲醇/甲苯/乙酸乙酯/乙酸；10/44/43/3（v/v/v/v）经TLC薄板获得的放射性峰的特征是通过它们的Rf值和分配到共色谱中的水杨酸的峰和可能的转化产物进行表征。典型的Rf值为：a）水杨酸：Rf=0.50–0.55b）2-羟基马尿酸：Rf=0.31–0.36c）龙胆酸：Rf=0.42–0.47此外，如果观察到的峰不能分配给任何添加的参考物质，则应用其Rf值描述它们并命名为转化产要确定CO2和CH4的矿化，参见附录B。可以通过在水/有机提取物，二氧化碳（14CO2甲烷（14CH4）和不可提取残留物（NER）中添加放射性量（[%添加放射性;（%aR）]）表示质量平衡：质量平衡[%aR]=提取物[%aR]+14CO2[aR]+14CH4[%aR]+NER[%aR]。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）半静态试验培养系统B.1半静态试验培养装置标引序号说明：1——氮气入口；2——含有去离子水的洗气瓶；3——含有粪肥的培养瓶；4——CO2收集器（例如，含有2MNaOH5——CO2收集器（例如，含有2MNaOH6——出口。图B.1半静态试验培养装置示例将粪肥样品添加到连接在半静态装置上的培养瓶3中。为了确保厌氧条件，用缓慢湿润的氮气流通过粪肥1h，以排除系统中的空气。用湿润的氮气流排气后，通过直接关闭分别在培养瓶和第二个NaOH捕集器5出口的阀门处的两个阀门来关闭系统。根据受试物及其潜在的转化产物的特点，可能需要不同的收集器（例如，乙二醇、硫酸）来收集挥发性有机物质。注意：培养瓶出口处的阀门可以保持打开状态，以增加半静态系统上方的空间，还可在第一个CO2收集器4处吸收培养过程中产生的CO2。此时，应在培养瓶3和CO2收集器4之间插入一个安全瓶（空洗瓶以防止在实验装置压力下降时，吸收溶液回流到培养瓶中。在培养期结束后，将各个培养瓶连接到后文总结的流动试验装置上，以检测生成的CO2、CH4和挥由于粪肥生成了气体，在培养期间，封闭实验装置中的压力会增加。所以为了避免挥发性物质损失导致无法达到质量平衡，可将该实验装置连接到流动试验装置上并定期用湿润的氮气排气（例如，每周GB/TXXXXX—XXXXB.2CO2、CH4和VFA的检测标引序号说明：2——装有去离子水的洗气瓶；3——含有粪肥的培养瓶；4——CO2捕集器（例如，含有2MNaOH5——CO2捕集器（例如，含有2MNaOH6——包含硅胶或碱石灰颗粒的空气/氧气旁路入口管路；7——带有石英玻璃管（填充CuO作为催化剂）的烘箱，800℃-850℃;8——CO2捕集器（例如，含有2MNaOH）。图B.2CO2、CH4和VFA的检测装置示例将加湿氮气以约50–200mL/min范围内的速率通过粪肥样品鼓泡至少1h。从粪肥样品中生成的14CO2，在含有CO2吸收剂（例如2MNaOH）的捕集阱（4和5）中运输和捕获。如果生成14CH4，它将通过CO2捕集阱（4和5）。加入氧气或环境空气6后，14CH4在800℃-850℃的燃烧管中催化（CuO）氧化，形成14CO2。生成的14CO2被吸收在位于燃烧管出口处的CO2捕集器8中。该装置可以区分转化生成的14CO2（在捕集阱4和5中捕获）和14CH4（在捕集阱8中捕获）。根据受试物及其潜在的转化产物，可能需要进一步的捕集阱（例如乙二醇，硫酸）来收集挥发性有机化合物。为了验证在CO2捕集阱[4]和[5]中捕集的放射性是14CO2而不是来自可能形成的挥发性脂肪酸（VFA可以进行放射性的BaCl2沉淀。计数捕集溶液4和5中的放射性。此后，将20mL0.25MBaCl2加入到10mL等分样品的捕集溶液4中，并且5每次发生Ba14CO3沉淀。然后再次对上清液进行放射性计数。沉淀后这种上清液中的放射性含量可归因于VFA，而沉淀前放射性含量减去沉淀后放射性含量的差异可归因于转化生成的14CO2。挥发物的定量捕集的挥发物的定量是通过对捕集溶液的等分样品的放射性计数（液态闪烁计数，LSC）来定量。GB/TXXXXX—XXXX特别是在使用半静态设置时，重要的是通过加入10mL10%HCl来酸化样品以释放捕集的CO2，然后进一步培养和捕集额外释放的CO2。可以通过以下方式实现：在加湿氮气通过粪肥样品鼓泡至少1h后，去除CO2捕集阱（4和5）并分别分析捕集的14CO2和其他产生的气体，如上所述。拆除的捕集阱被新填充的捕集阱取代。此后，在该特定采样点移出粪肥培养瓶，通过加入10mL10%HCl去除潜在溶解的CO2（或HCO3-/CO32-）。加入10mL10%HCl后，再次关闭培养瓶，并将湿润的氮气通过粪肥鼓泡至少24h。不要搅拌样品以避免起泡。如果仍然观察到发泡，则应在培养期间缓慢添加酸（例如滴加酸）。此后，移出粪肥培养瓶，清理并提取粪肥。CO2捕集阱也被移出，并针对额外捕阱的CO2进行放射性计数。注意：在向粪肥中添加10%HCl之前，必须检查受试物和转化产物在酸性条件下是否稳定。如果不稳定，则必须为此目的培养设置更多的试验组。具有高矿化度的受试物，建议至少吹扫24h，但可能需要长达数天的时间段才能完全捕阱14CO2。如果预计以在初步试验组中确定最佳清除时间。如果转化产物未知，则无法进行稳定性检查GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）流动试验培养系统图C.1流动试验装置示例CO2、CH4和VFA（挥发性脂肪酸）的区分湿润氮气以约50-200mL/min的速率通过粪肥样品。在恒定N2气流下，从粪肥样品中产生的14CO2经含CO2吸收剂（如2MNaOH）的捕集阱1和安全阱2中捕集。14CH4可以正常通过CO2捕集阱。通入氧气后，在800-850℃燃烧管中催化氧化(催化剂CuO)，生成14CO2。这些14CO2被燃烧管出口的CO2捕集阱收集。GB/TXXXXX—XXXX此装置可以区分14CO2（在阱1和2中收集）和14CH4（阱3）。根据受试物及其可能的转化产物，需要其他捕集器（例如乙二醇、硫酸）来收集其他挥发性有机物。为了验证在阱1、2中捕获的放射性物质是14CO2而不是可能存在的挥发性脂肪酸(VFA)，可以用BaCl2对放射性物质进行沉淀。对捕集溶液（阱1和2中）的放射性进行计数。然后将20mL0.25M的BaCl2添加到10mL捕集溶液中，产生Ba14CO3沉淀。再次对上清液进行放射性计数。沉淀处理后上清液的放射性含量可归因于挥发性脂肪酸（VFA而沉淀前放射性总量减去沉淀后溶液的放射性的差值可归因于产生的14CO2。挥发性化合物的定量捕集的挥发性物质是通过对捕集溶液的样品进行放射性计数（液态闪烁计数，LSC）来实现定量的。此外，为了证明润湿的氮气通过粪肥样品时是否产生了14CO2，可以通过向粪肥子样品中添加HCl以溶解在粪肥基质中的CO2（或HCO3-/CO32-）。如果14CO2的量超过总放射性(TRR)的10%，则应添加HCl进行吹扫。捕集物的量化可以通过以下方式实现：移除捕集阱（阱1和2并分别分析捕集的14CO2和其他逸出气体，移除的捕集器被新增的气体捕集阱取代。此后，在该特定采样点移出粪肥培养瓶，通过加入10mL10%HCl去除潜在溶解的CO2（或HCO3-/CO32-）。加入10mL10%HCl后，再次关闭培养瓶，并将湿润的氮气通过粪肥鼓泡至少24h。不要搅拌样品以避免起泡。如果仍然观察到发泡，则应在培养期间缓慢添加酸（例如滴加酸）。此后，移出粪肥培养瓶，清理并提取粪肥。CO2捕集阱也被移出，并针对额外捕获的CO2进行放射性计数。为了避免因气体不断变化而造成的干扰和污染，采样应从靠近出口的样品开始。注意：在向粪肥子样品中添HCl前，必须验证受试物和转化产物在酸性条件下是否稳定。若不稳定，则必须设置更多的试验组。注：如果转化产物未知，则无法进行稳定性检查。可以进行预试验（资料性附录）D.1：报告示例-在液态粪肥中的厌氧转化试验中测量出的放射性分布GB/TXXXXXXXXX—表D.GB/TXXXXXXXXX—时间/d母体物质转化产物矿化(CO2+CH4)NER不可提取的残留物质量平衡R1R2MeanR1R2MeanR1R2MeanR1R2MeanR1R2Mean091.097.094.0ndndndndndndndndnd91.097.094.0280.082.081.0ndndndndndndndndnd80.082.081.0575.076.075.5ndndndndndnd23.121.922.598.197.998.067.066.066.5ndndndndndnd25.224.725.092.290.791.560.059.059.5ndndndndndnd36.733.335.096.792.394.52753.055.054.0ndndndndndnd45.342.744.098.397.798.03549.051.050.02.2ndndnd36.733.935.387.986.287.15038.040.039.05.76.05.9ndndnd53.452.352.997.198.397.76533.034.033.59.7ndndnd47.545.946.791.389.690.57829.033.031.0ndndnd46.947.147.088.495.892.19034.030.032.0ndndnd44.943.744.388.382.285.3LOD0.3%0.5%0.3%0.5%-LOQ0.5%1.0%0.5%1.0%-GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）粪肥基质参数和DT50值的变异系数粪肥基质参数与其他环境基质例如土壤或沉积物相比，粪肥的基质参数变化较小。尽管粪肥选择多样化，但方法开发和验证的数据显示，基质参数的范围很窄。牛粪：干物质：9.9±2.2%有机质（Corg4.1±0.9%pH冬季（pHwinter）:7.3±0.4pH夏季（pHsummer）:6.9±0.2猪粪：干物质：5.2±3.2%有机质：2.1±1.3%pH:7.3±0.1DT50值FOCUS（2000）估算了不同土壤间的DT50的变异系数（COV）大约为100%。基于此，粪肥方法的开发、验证研究和监管研究的信息，获取到的平均COV为38%。表E.1不同土壤和粪肥间的变异系数 20%-57%（n=9）相同的物质EMA2018）GB/TXXXXX—XXXX参考文献[1]WeinfurtnerK.(2010).Matrixparametersandstorageconditionsofmanure.UBA-Texte02/2011,ISSN1862-4804.Umweltbundesamt,Dessau-Roßlau,1-54,http://www.uba.de/uba-info-medien-e/4054.html[2]JunkerT,AtorfC,BerknerS,DüringR-A,HenneckeD,HerrchenM,KonradiS,Merrettig-BrunsU,RömbkeJ,WagnerJ,WeinfurtnerK(2020).Developmentofatestmethodfortransformationofveterinarypharmaceuticalsandbiocidesinanaerobicliquidmanure.EnvironmentalSciencesEurope32:39.[3]OECD(2002a).TestNo.307:AerobicandAnaerobicTransformationinSoil,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section3,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070509-en.[4]OECD(2002b).TestNo.308:AerobicandAnaerobicTransformationinAquaticSedimentSystems,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section3,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070523-en.[5]ISO(2021).ISO10390:ISO10390Soil,treatedbiowasteandsludge-DeterminationofpH.InternationalOrganizationforStandardization,Geneva,2021.[6]DIN(2001).DINEN12879:2001-02:Characterizationofsludges-Determinationofthelossonignitionofdrymass.DeutschesInstitutfürNormung,Berlin.[7]ISO(1995).ISO11261:Soilquality-Determinationoftotalnitrogen-ModifiedKjeldahlmethod.InternationalOrganizationforStandardization,Geneva,1995.[8]ISO(1984).ISO5664:Waterquality-Determinationofammonium-Distillationandtitrationmethod.InternationalOrganizationforStandardization,Geneva,1984.[9]ISO(2002).ISO11271:Soilquality-Determinationofredoxpotential-Fieldmethod.InternationalOrganizationforStandardization,Geneva,2002.[10]DIN(1984).DIN38404-6:1984-05:Germanstandardmethodsfortheexaminationofwater,wastewaterandsludge;physicalandphysico-chemicalparameters(groupC);determinationoftheoxidationreduction(redox)potential(C6).DeutschesInstitutfürNormung,Berlin,May1984.[11]DIN(2001).DINEN12880:2001-02:Characterizationofsludges-Determinationofdryresidueandwatercontent.DeutschesInstitutfürNormung,Berlin.[12]EFSA(2007).OpiniononarequestfromEFSArelatedtothedefaultQ10valueusedtodescribethetemperatureeffectontransformationratesofpesticidesinsoil.TheEFSAJournal622:1-32.[13]OECD(2002b).TestNo.308:AerobicandAnaerobicTransformation