《小分子有机化合物内标法定量分析核磁共振氢谱法》

T/CSTMXXXXX—2020

《小分子有机化合物内标法定量分析核磁共振氢谱法》

警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问

题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准适用于小分子有机化合物（分子量≤900）的绝对定量中的内标法而拟定的，因此，本文件

适用于核磁共振氢谱的内标法定量分析。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

中国药典（四部）2020年版通则0441核磁共振波谱法

《JJF1448-2014超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪校准规范》

《JY/T0578-2020超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱测试方法通则》

GUIDELINEFORqNMRANALYSIS欧洲法庭科学研究机构2020年1月通过的核磁定量分析指南

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1纵向弛豫时间T1longitudinalrelaxationT1

在满足共振条件时，总宏观磁化矢量倾倒，纵向磁化矢量从零恢复到初始状态的时间即在施加射频

脉冲后重新建立磁化热平衡的时间参数。T1值与浓度，温度，氧含量和磁场强度有很大的关系。

3.2弛豫延迟时间relaxationdelaytimeD1

弛豫延迟时间是每次脉冲发射前的等待时间。

3.3激发角度flipangle

在射频脉冲作用下磁化矢量翻转的角度。

3.4信噪比signaltonoiseS/N

核磁图谱中信号强度和噪声强度的比值。一般定量实验中，特征峰的信噪比至少需要达到150以上，

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以保证积分定量结果的准确。

3.5扫描次数numberofscansNS

扫描次数是重复采样的次数以得到最终的原始FID信号，在进行定量分析时，扫描次数应适当，

以满足信噪比的要求。

3.6采样点数timedomainTD

未经傅里叶变换之前的原始数据的采集点数，采样点数增大，可以增加图谱的分辨率，但同时也将

增加采集时间。

3.7谱宽spectralwidthorsweepwidthSW

谱宽指观测核共振频率扫描的宽度。谱宽需要能覆盖需检测的频率区间，应包含所有谱线，宜设置

为所有谱线的区域宽的120%左右。

3.8采集时间acquisitiontimeAQ

采集时间是射频脉冲激发原子核后接收线圈去接收自由感应衰减（FID）信号的时间，采样时间等

于采样点数（TD）与二倍谱宽的比值，AQ=TD/(2×SW)。合适的采样时间可以保证FID信号能够衰

减完全，从而提高分辨率。

3.9分辨率resolution

仪器分辨两个相邻共振谱峰的能力，核磁中用特定标样的谱峰半峰宽来反应仪器的分辨率。

3.10目标化合物targetcompound

指待测样品中需要进行含量测定的化合物。

4.仪器的准备和校准

4.1氢谱的线型和分辨率

按照《JJF1448-2014超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪校准规范》，定期利用氢谱的线型样品（1%

或0.3%CHCl3inacetone-d6）对仪器的性能进行评估。线型样品图谱采集之前，预先进行一次3D匀场

（2mM蔗糖/0.5mMDSS/2mMNaN310%D2O/90%H2O），400-500M宜每半年进行一次3D匀场，600M

及以上的仪器宜每季度进行一次3D匀场。3D匀场完成后，将线型样品放入磁体中，在探头精确调谐

和磁场均匀的状态下，在规定条件下采集1H，进行傅里叶变换，调整相位后，获得图谱。计算氯仿谱

线的50%峰高出的峰宽W1/2（即为氢谱的分辨率），氯仿谱线的卫星峰和卫星峰1/5高度处的线宽值为

W0.55%和W0.11%（即为氢谱的线型），得到的峰宽值应满足JJF1448-2014中的技术指标。

4.2氢通道的90°脉宽校准

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将标准样品（0.1%乙基苯的CDCl3溶液）放入磁体中，经锁场，匀场和调谐后，采集一个常规氢

谱，将相位调整好；根据平时90°脉宽的长度预估计360°脉宽的长度，并将此值设成P1值，重新采

集氢谱，并进行傅里叶变换，相位值不能更改，此时应得到一个没有信号的图谱。如果信号为正，应降

低P1值，如果信号为负，应增加P1值，直至合适的P1值从而采集得到没有信号的图谱。此时的P1

值即为360°脉宽，将其除以4可得此时PL1下的90°脉宽。

表一氢谱采集参数

参数值参数值

脉冲序列zgDS0

功率PL1给定值NS1

P13usD130s

SWH1000HzO1P2.6ppm

5.待测样品的定性分析

按照一般氢谱采集的方法对待测样品进行检测，其目的是了解目标化合物的性质，包括其在所选氘

代试剂中的溶解性和稳定性，以及该化合物的氢谱的基本情况，选定该化合物的特征峰。特征峰应尽量

选择与其它的峰分离度好，易于识别的峰；其质子在结构中所处的化学环境尽量和内标物的特征峰质子

相近；活泼氢不宜选为定量峰。

6.内标物的选择

内标法测定有机化合物的含量是将待测样品和内标物置于同一溶剂中，转入核磁管后同时测定样品和内

标物的共振谱峰，因此，在内标物选择时，应遵循以下原则：

6.1化学反应惰性所选内标物不得与待测样品和所选的氘代溶剂发生反应。

6.2溶解性所选内标物应在所选的氘代溶剂溶解性好，至少要保证所称量的内标物在所用体积内的氘

代溶剂中完全溶解，如果内标物没有完全溶解，则会造成目标化合物含量高于真实值。

6.3分离度所选内标物的特征峰应与待测样品的共振峰相分离，分离度不够容易造成积分不准确，从

而影响化合物含量的结果准确性。内标物选择分离度提高存在困难时，可以尝试更换溶剂或者改用频率

更高的仪器，以改善分离度。

6.4内标物的溯源性一般建议使用有证的可溯源性内标物，当获取有证的可溯源性内标物存在困难时，

应能保证目前所用的内标物可溯源到有证的可溯源的标准物质。

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表二常见内标物的性质和溶解性

内标物结构分子量Δ溶解性

(g/mol)(ppm)D2ODMSO-d6CD3ODCDCl3

马来酸116.076.0~6.3√√√×

富马酸116.076.6~6.8√√√×

醋酸钠82.031.6~1.9√√√×

二甲砜94.133.0√√√√

TSP-d4150.290.0√√√×

1,3,5-三168.196.1；×√√√

甲氧基3.7~3.8

苯

1,4-二硝168.118.2~8.5×√√√

基苯

1,4,5-三182.438.5~8.8×√√√

氯吡啶

7.样品的准备

7.1样品的数量为了防止样品准备中出现差错，每个待测样品至少应配两次进行检测。

7.2待测样品重量样品称量的准确与否是影响定量结果准确性的重要因素之一。为了保证重量的准确

性，最低样品量取决于天平的最小取样量，而最大样品量取决于待测样品和内标物的溶解度，同时待测

样品的特征峰和内标物的特征峰摩尔比宜控制在1：1或者2：1左右。在利用氢谱进行定量分析时，在

5mm核磁管的0.5mL溶剂中，含待测样品5~15mg较为适宜。

7.3不溶物若不溶物沉淀在核磁管底部或者漂浮在核磁管样品溶液的上方，均不会影响采集；若是有

不溶物悬浮在整个样品溶液中，有可能会影响匀场。不溶物不得含有内标物和目标化合物，如内标物没

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有完全溶解，会造成目标化合物的含量偏高，如目标化合物没有完全溶解，会造成目标化合物的含量偏

低。为了防止出现目标化合物溶解不完全的情况，因此每个待测样品配置两次时，待测样品的重量宜有

些差别，如一个6mg，另一个10mg。

8.实验采集

8.1弛豫延迟时间D1根据待测样品和内标物特征峰的纵向弛豫时间T1来设置弛豫等待时间D1，D1的

设置应大于5倍T1，当D1设置为7倍的T1时间时，99.9%可以获得弛豫，当D1设置为5倍的T1时间

时，99.3%可以获得弛豫，这意味着7倍T1的等待时间可以将误差从0.7%降低到0.1%，这对于整个准

确度要求控制在1.0%内时非常重要。在有机化合物中，一般质子的弛豫时间都小于10s，只有一些小分

子例外，如甲酸钙和某些对称性非常高的分子，需要注意的是这些化合物由于特征峰明显，经常被选为

内标物，这时候实验时间会增长。弛豫延迟时间D1，脉宽的长度和采集时间构成了每次采集的重复时

间，只要整个的重复时间达到70s，即可达到99.9%的弛豫，达到所需的准确性，因此，D1设置为63s

较为适宜。

8.2激发角度采用90°角激发。与常规氢谱采集时一般采用30°角激发相比，90°角激发可以获得其

两倍的信噪比（要获同样的信噪比，若用30°角激发的话，扫描次数要翻4倍）。完全弛豫一般要求

D1等待时间是特征峰和内标物峰质子中较长弛豫时间的7倍，而30°角激发，D1等待时间仅能缩短

到6倍的特征峰和内标物峰质子中较长弛豫时间。因此，90°角激发是更好的选择。

8.3采集时间采集时间5-8s足够，一般采用7s。采集时间由采样点数和谱宽决定。采集时间需要足够

的长，能够覆盖完整的FID信号，但也并不是越长越好，若自由感应衰减信号消失后，采集到的仅是噪

音信号。

8.4扫描次数采集次数是根据所选择的特征峰要求的信噪比来决定，信噪比需要达到150：1以上，而

信噪比对核磁积分的准确度有非常重要的影响。信噪比对积分的影响用相对标准偏差来估算（公式

RSD=86/SN），若信噪比为86，那么对积分带来的不确定度为1%。信噪比与采集次数的平方根成正比，

这意味着若要得到翻倍的信噪比，需要4倍的采集时间来获得。

8.5发射中心发射中心应设置在待测物的特征峰和内标物的特征峰的中间，避免由于未能均匀激发造

成的偏差。

9.处理和处理参数

9.1零填充零填充可以增加积分的准确性，将处理参数中的SI设置为采集参数中的TD若干倍数即可，

如设置SI=2*TD可以满足要求。

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9.2窗函数如果由于样品量不够或者采集时间过长造成信噪比过低，可以通过添加窗函数LB（0.2~1Hz）

来提高信噪比，如将氢谱的窗函数LB设置为0.3。值得注意的是，添加窗函数会导致图谱的分辨率降

低。

9.3相位调整相位调整可以采用自动相位调整，若自动相位调整未达到预期目的，可以采用手动相位

调整。

9.4基线校正基线校正可以采用自动基线校正，若自动基线校正未达到预期目的，可以采用手动校正。

9.5积分为保证99%的峰面积的准确积分，积分区域应至少保证为半峰宽的20倍，如果这个区域范围

出现峰的重叠，可以适当缩窄这个范围，但是必须同时对目标化合物和内标物的特征峰范围进行缩窄。

此外，如果13C的卫星峰出现，对目标化合物和内标物的特征峰进行积分时，要么同时包含卫星峰，要

么同时都不含卫星峰。若峰重叠无法用改变溶剂或者其他手段实现，这时可以采用峰去卷积的办法。

10.含量计算

目标化合物的含量可按照下面的公式进行计算：

P=（I目标化合物/I内标物）*（N内标物/N目标化合物）*（M目标化合物/M内标物）*（W内标物/W待测物）*P内标物

I目标化合物：目标化合物特征峰的积分面积；

I内标物：内标物特征峰的积分面积；

N内标物：内标物特征峰的质子数

N目标化合物：目标化合物特征峰的质子数；

M目标化合物：目标化合物的分子量；

M内标物：内标物的分子量；

W内标物：内标物的重量；

W待测物：待测化合物的重量；

P内标物：内标物的纯度。

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附录A

（规范性）

专业评价项目

A超导核磁共振谱仪

氢谱的分辨力和线型评价标准——JJF1448-2014

表A.1超导核磁共振谱仪1H分辨力和线型技术指标

不同工作频率磁体

序号项目

400M500M600M800M

1

H分辨力W1/2≤0.7Hz≤0.8Hz≤0.9Hz≤1.0Hz

W0.55%≤13Hz≤14Hz≤15Hz≤16Hz

1H线型

W0.11%≤22Hz≤24Hz≤26Hz≤28Hz

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附录B

（资料性附录）

氢谱相对定量分析实例

例：利用核磁共振氢谱相对定量的方法测定多纳菲尼的氘代率

A)测量方法按照上述标准的要求，利用氢谱测定该化合物结构中的氘代率，实验结果以百分数表示。

B)简述9家实验室的11台仪器参加比对实验，小分子化合物甲苯磺酸多纳非尼的氘代率检测结果均在

99.8%以上，相对偏差为1.5*10-4.

C)检测结果

实验室i仪器型号123积分平均值氘代率%

1Bruker6000.390.39NA0.3999.87

2Varian6000.340.33NA0.3499.87

3Bruker5000.260.31NA0.2999.90

4Bruker6000.41NANA0.4199.86

5JNM-ECZ5000.47NANA0.4799.84

6Bruker5000.500.50NA0.5099.83

7Bruker4000.450.43NA0.4499.85

7Bruker6000.440.43NA0.4499.85

8Quantun-Iplus4000.400.42NA0.4199.86

9Bruker5000.540.480.510.5199.83

9Bruker6000.470.350.510.4499.85

氢谱绝对定量分析实例

例：利用核磁共振氢谱绝对定量的方法测定马来酸的含量

A）样品的制备MA-1和MA-2：取待测样品马来酸约13mg，内标物二甲砜（99.9%）约6.5mg，分别精

密称定后，用约10mLd6-DMSO溶解，待样品完全溶解后，取约0.6mL转入核磁管中，待用。同样的方

法制备平行样。MA-3和MA-4：取待测样品马来酸约5.2mg，内标物二甲砜（99.9%）约13mg，分别精密

称定后，用约10mLd6-DMSO溶解，待样品完全溶解后，取约0.6mL转入核磁管中，待用。同样的方法

制备平行样。

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B）测量方法参照上述标准，弛豫时间（设置大于5倍T1即可，本次对比实验为了降低误差，设置大于

7倍T1，建议用63s）；激发角度（90度）；采集时间（采集时间需要足够的长，能够覆盖完整的FID信

号，5~8s即可）；发射中心（4.6ppm）；谱宽（20ppm）；采集次数（根据探头的灵敏度设置，达到所

需的信噪比≥1000：1）。

C）简述共有来自9家实验室的11台仪器参加比对实验，在满足（GB/T6379.2-2004/ISO5725-2:1994）

的精密度要求下，以目前核磁定量分析允许的误差为5%为临界差，即，9家委托机构

Yu0/u05%

的测试结果满足准确度的要求。

D）检测结果

精密准确度

实验仪器型MA度评评价结

平均值u0/u0

室i号系列Y1Y2平均Y1Y2r价结论

值论（<5%）

MA-199.499.599.450.10.878符合0.4%符合

BrukerMA-299.399.599.40.21.144符合0.4%符合

1

600MA-398.998.998.900.966符合0.9%符合

MA-498.698.698.600.567符合1.2%符合

MA-198.598.498.450.10.878符合1.4%符合

Varian

2MA-298.999.499.150.51.144符合0.6%符合

600

MA-398.999.499.20.50.966符合0.6%符合

MA-196.997.797.30.80.878符合2.5%符合

BrukerMA-297.797.597.60.21.144符合2.2%符合

3

500MA-398.398.198.20.20.966符合1.6%符合

MA-498.197.697.850.50.567符合2.0%符合

MA-196.795.996.30.80.878符合3.5%符合

BrukerMA-296.095.295.60.81.144符合4.2%符合

4

600MA-398.298.398.250.10.966符合1.6%符合

MA-498.097.897.90.20.567符合1.9%符合

MA-199.599.799.60.10.878符合0.2%符合

JNM-ECMA-299.899.699.70.21.144符合0.1%符合

5

Z500MA-399.799.699.650.10.966符合0.2%符合

MA-499.699.799.650.10.567符合0.2%符合

MA-199.499.299.30.10.878符合0.5%符合

BrukerMA-299.199.599.30.41.144符合0.5%符合

6

500MA-399.3100.199.70.80.966符合0.1%符合

MA-499.098.498.70.60.567符合1.1%符合

MA-196.696.396.450.30.878符合3.4%符合

Bruker

7MA-297.496.596.950.91.144符合2.9%符合

400

MA-395.694.995.250.70.966符合4.6%符合

11

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MA-497.197.297.150.10.567符合2.7%符合

MA-197.297.097.10.20.878符合2.7%符合

Bruker

7MA-295.595.395.40.21.144符合4.4%符合

600

MA-396.196.196.100.966符合3.7%符合

MA-199.098.598.750.50.878符合1.0%符合

QuantunMA-299.699.099.30.61.144符合0.5%符合

8

-Iplus400MA-398.498.598.450.10.966符合1.4%符合

MA-498.898.398.550.50.567符合1.3%符合

MA-199.699.499.50.20.878符合0.3%符合

BrukerMA-299.999.899.850.11.144符合0.1%符合

9

500MA-398.799.699.150.90.966符合0.6%符合

MA-499.899.899.800.567符合0符合

MA-199.499.699.50.20.878符合0.3%符合

BrukerMA-299.999.999.901.144符合0.1%符合

9

600MA-399.598.999.20.60.966符合0.6%符合

MA-499.198.798.90.40.567符合0.9%符合

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附录C

（资料性附录）

起草单位和主要起草人

本文件起草单位：中关村材料试验技术联盟、中国科学院上海有机化学研究所、中国科学院上海药

物研究所、中国科学院精密测量科学与技术创新研究院、武汉中科牛津波谱技术有限公司、上海张江药

谷公共服务平台有限公司、杭州泽邦科技有限公司、上海化工研究院有限公司、中国科学院成都生物研

究所和公安部第三研究所标准物质实验室。

本文件主要起草人：吴剑、夏薇、张茜、郭寅龙、施燕红、胡淑炜、张乃霞、刘惠丽、刘红兵、

罗欢、陈照、颜贤忠、鲁玉梅、黄淼、姜涛、谭艳云、胡志鹏、王伟、解龙、雷雯、方冬梅、蒋艳、戚

华溢、周燕、孙喆明。

参考文献

1.《JY/T0578-2020超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱测试方法通则》

2.《JJF1448-2014超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪校准规范》

3.中国药典（四部）2020年版通则0441核磁共振波谱法

4.JISK0138:2018定量核磁気共鳴分光法通則

5.https://enfsi.eu/wp-content/uploads/2017/06/qNMR-Guideline_version001.pdf

6./sites/default/files/usp/document/workshops/stimuli-article-qnmr.pdf

7.nmrweb.chem.ox.ac.uk/Data/Sites/70/userfiles/pdfs/quantitative-nmr.pdf

1

ICSXX.XXX.XX

CCSXXXX

团体标准

T/CSTMXXXXX—202X

《小分子有机化合物内标法定量分析核

磁共振氢谱法》

ProtonquantitativeNMR(1HqNMR)forsmallorganicmoleculesanalysis

(internalstandardmethod)

202X-XX-XX发布202X-XX-XX实施

中关村材料试验技术联盟发布

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《小分子有机化合物内标法定量分析核磁共振氢谱法》

警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问

题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准适用于小分子有机化合物（分子量≤900）的绝对定量中的内标法而拟定的，因此，本文件

适用于核磁共振氢谱的内标法定量分析。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

中国药典（四部）2020年版通则0