工业微生物育种学9VIP

本节主要内容产量突变株的筛选1筛选程序2常用筛选方法3摇瓶液体培养4产物活性测定5摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察分析6培养基和培养条件的调整7菌种特性的研究第三节突变株的分离与筛选关于产量突变产量突变株难以筛选：①微生物正突变几率极小，仅0.05~0.2%，产量提高幅度不大，大约在5~15%。②而筛选中的实验误差约有10以上，常常会掩盖变异提高的幅度范围。这就要求有个合理、科学、快速、简便的筛选方法突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突变体高产性能等优良特性总是在一定的培养条件下才能表现出来。为了能有效地筛选突变株，必须采用能使突变体表型得以充分表达的筛选条件。培养基和培养条件就是筛选的“筛子”。关于筛选筛选条件⑴首先要设计一个良好的筛选培养基和确定适合的培养条件。⑵同时培养基和培养条件应尽量力求和大生产一致，才能使选育的菌株应用于生产上。一、筛选的程序第一代：出发菌株诱变分离到平皿上挑选菌落初筛2001瓶/株50株复筛3~5瓶/株4株第二代：出发菌株4株诱变分离到平皿上挑选菌落400初筛1瓶/株50株复筛3~5瓶/株4株二、常用的筛选方法1随机筛选2平板菌落预筛法随机筛选法随机筛选又叫摇瓶筛选，意思是将随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。具体做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落接入一支斜面，然后一个斜面的菌体接入一只三角瓶中，放在摇床上振荡培养，根据测定的产物活性的高低决定取舍。随机筛选法优点：与发酵罐大生产条件比较相近，可以模拟进行。缺点：①在突变几率小的情况下，如果菌落挑选少了，很难筛选到理想的突变株。高产菌株几率越低筛选菌落数量就越大。根据瑟芝帝工作法，如果突变频率为1%，那么初筛挑选菌落起码要200个。②初筛用摇瓶发酵培养，不仅花费巨大的人力，而且周期长，限制了筛选量，影响高产菌株的筛选率。平板菌落预筛法在琼脂平板上可设计出多种巧妙的筛选方法和活性粗测方法。大量菌落经过平板预筛，可保留5~10%的初筛优良菌株约200株，再进行摇瓶发酵培养，复证优良菌株的重演性，同时从200株优良菌株中筛选出更高产量的突变株。平板菌落预筛法比随机挑选菌落效率高得多。平板菌落预筛法1形态变异观察法2菌落生化反应测定法3浓度梯度法4影印法5琼脂块法1形态变异观察法例1：赤霉素产生菌，诱变后产生色素由暗红色变深的菌落产量下降。例2：红霉素产生菌，若突变株带色素，往往都是低产株。例3：一些产孢子的菌株突变后不产孢子这些都是要淘汰掉的。在菌落形态变化方面有这样的趋向：原来具有较高发酵水平的菌种作为出发菌株时，由突变引起形态剧烈变化的菌落是一些代谢严重失调的菌株，常常负突变占多数，而高产菌株的形态往往处在常态的正常型范围内，因为它们的遗传物质仅受到微小的损伤，一个菌株的高产性能是经过多代微小突变累积的。为防止优良菌株漏筛，每次诱变后挑选菌落要避免形态显著变化的菌落，但要十分注意观察、比较与正常型菌落形态的微细变化。往往一些不为人注意的微小变化却是高产的源头。值得注意的是2菌落生化反应测定法蛋白酶突变株的筛选——酪素淀粉酶突变株的筛选——碘谷氨酸突变株的筛选——溴百里酚蓝3浓度梯度法一个菌株产生抗生素的水平与其耐自身产物的能力大小有关。野生菌总比高产菌耐自身抗生素能力差，也就是说，菌株产抗生素水平受到它自身所产抗生素数量的严格制约，耐受性越高，抗生素产生能力越强。为此在诱变分离突变体时，可在平皿中加入该菌株所产的抗生素。浓度梯度双重平板的制备4影印法5琼脂块法琼脂块法琼脂块法的原理是将每一个分离的菌落连同其下面的培养基一同放在生物鉴定板上培养一段时间，这样每个菌落的生活环境是一样的，培养基的体积相同，而且相互之间不受影响，有利于判断产量的高低。通过此法，可以分离淘汰大部分低产菌株（大约95%），取其中5%左右上摇瓶复筛。是由日本人八木创造的琼脂块法的优点琼脂块法比一般直接分离在平皿上判断活性的反应圈要准确。首先，限制了所有菌落都在同一面积的琼脂块上生长，避免了相互间的干扰；其次，每个菌落的产物都在同一体积的琼脂块中，从环境中摄取的营养是一致的，避免由于扩散不同造成的误差，这样能较准确地反映每个菌落的生产能力。第三，可大幅度地提高参选量，比常规的筛选提高15~20倍。琼脂块产量的测定1测量鉴定板上扩散圈直径。2把琼脂块中的产物用水或有机溶剂抽提出来，然后采用该产物的常规测定方法测定抽提液中的含量。扩散圈直径测量法的评价优点是操作方便、效率高、筛选量大。缺点是产物的产量与其形成的扩散圈直径之间当浓度过高时，不能保持线性关系。所以琼脂块法只适用于大量筛选的初筛阶段。为了提高准确性，最好用活性放大仪测量反应圈，可以减少误差。更理想的方法是采用图象识别技术测定扩散圈的面积。产物抽提法优点是用定量分析法测定抽提液中产物含量，准确性高。缺点是操作繁琐，工作量大，限制了筛选量。诱变后的琼脂平板上会出现大小不同的菌落。一般总认为，由小菌落产生的扩散圈比较小，由大菌落形成的扩散圈比较大，实际上并不完全是这样的。在实际工作中易忽视前者，挑选后者，造成漏筛。为了避免这种现象。有的研究人员用菌落直径与扩散圈直径比值来衡量。值得注意的是注：A：透明圈直径(mm)；B：菌落直径(mm)；D/d：A/B；C：滤纸条腐烂程度；表中“+”滤纸不断裂，滤纸有毛边；“++”滤纸断裂，振摇不成湖状；“+++”滤纸断裂，振摇成有碎片糊状；“++++”滤纸断裂，振摇成均匀糊状。三、摇瓶液体培养常规随机筛选的全过成都要通过摇瓶培养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量低产菌株，将被挑选的菌株进行摇瓶培养，逐步筛选出高产菌株。摇瓶培养与大生产的关系摇瓶培养相对于平板培养来说更接近于大生产中使用的发酵罐，但是它毕竟不是发酵罐，设备差距还是很大的，要完全统一两个体系的工艺条件是有一定难度的。通常人们是以选择溶氧系数相等为依据来确定工艺条件的。摇瓶筛选，实际上是各变异菌株之间的对比试验，有关摇瓶的各种条件要力求一致，如摇瓶型号、装量、瓶塞厚度、摇瓶转速、温度等都要一致，同时还要注意实验瓶在摇瓶机上的层次、位置以及室内的相对温度，同时他们都会不同程度影响实验结果。值得注意的是四、产物活性测定根据一般突变规律，一个出发菌株通过一次诱发突变，生产能力提高5%的突变株约1/50，而生产能力提高10%以上的突变率仅在1/300左右。由此可见，初筛的菌株越多，优良菌株漏筛的几率越少。扩大筛选量，是提高育种效率很重要的一个方面。产物活性测定的方法⑴琼脂平板孔洞法⑵纸片法⑶琼脂薄层纸片法琼脂平板孔洞法①将一定量的底物和1.6%~1.8%琼脂做成厚约3mm的平板，凝固后用内径5mm的打孔器，取出一个个琼脂块，50~60/板；②加入过滤或离心后的发酵液10μL，每个菌株注意编号；③置于底物作用温度下，培育20~25h；④在孔四周出现水解圈；⑤根据水解圈的大小决定取舍。酶类产生菌突变株的筛选琼脂平板孔洞的法的评价如果发酵液中产物浓度控制在一定范围内，其水解圈大小与产物的活性成线性关系，结果比较准确。但是该法毕竟比较粗放，试样活性只能和出发菌株对比，难以测出绝对值，所以比较适合大量样品的初筛阶段。纸片法①取直径0.5cm圆滤纸片，灭菌后覆盖于含有底物或检菌的琼脂板上；②用微量进样器吸取发酵液1~2μL在滤纸片上；③置于一定温度下培养25~30小时；④测量水解圈大小。可以通过稀释发酵液的办法控制水解圈的范围。纸片法的评价当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈的大小与产物的浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛。此时，常可改用纸片法。琼脂薄层纸片法①制备病原菌的孢子悬液；②把它们加入到45℃~50℃的真菌培养基中，混匀，倒在玻璃板（20×10cm）上，均匀摊平制成厚约1mm的薄层琼脂板；③将圆滤纸片依次覆于琼脂板上，用注射器加入1~2μL诱变菌株的发酵液（4×15~18个），并编号；④将琼脂玻璃板放在搪瓷盘内，两端放两玻璃条，上盖一块灭过菌的玻璃板；⑤在搪瓷盘底部放置浸湿的纱布，以保持湿度；⑥加盖，适宜温度下，大约培养3~4天；⑦置于立体显微镜或解剖镜下观察孢子的萌发，菌丝形态，并测量抑菌圈的大小。琼脂薄层纸片法琼脂薄层纸片法的评价可以根据孢子不发芽、芽管或菌丝不伸长、芽管或菌丝畸形、孢子不形成等进行分类，作为抑菌试验的有效标志。琼脂薄片法具有灵敏、简便和微观性，更适合抗生素高产菌的初筛，是符合对大量菌株和多种产孢子真菌、病原菌为对象的综合筛选。琼脂板孔洞法和纸片法（琼脂薄层纸片法），最好用活性圈放大仪来测量，以减少误差。有时可选择用大试管代替三角瓶来进行发酵，可提高初筛试验的规模。五、摇瓶数据的调整

和有关菌株特性的观察分析菌株产量检测中误差的来源：一个是摇瓶培养条件变化而影响遗传特性的表达；另一个是检测过程中的误差。用生物统计学进行测试数据的处理。意义在于从复杂的数据中，去伪存真，抓住本质，总结出真正的规律。有关菌株特性的观察和分析应贯穿于整个试验过程中，每个阶段都要周密地观察菌株的特性，并详细地做记录，以帮助初筛时挑选菌落，和选择诱变条件。六、培养基和培养条件的调整高产性状的表达环境因素具有选择作用，对不适应的突变体，其优良性状不讷讷感表达，甚至被淘汰。对诱变1~2代后的优良菌株，要进行培养基或培养条件的改变或改进，尤其要调整配方，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，因而表现为更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。表型=基因型+环境作用菌株号培养基和培养条件组合编号1234567M-10165120204316M-1062405306461938M-2066908563164M-306870126019604492M-406167220704952M-506551271807500M-60678009500

抗霉菌素A产生菌在不同环境条件下的生产能力（μg/mL）正交试验正交试验的意义：1用少数几个处理，就能获得比较丰富的试验信息，得出全面的结论；2能表明试验因素间的交互作用；3试验误差也得以恰当的估计。正交试验使根本无法进行的多因素试验成为可能。正交试验设计的步骤1确定试验的培养基组分（因素）和每种组分的含量（水平）；2选用正交表；3表头设计，根据正交表中基本列、交互作用列的位置以及试验的要求，把要考察的各个因素放在正交表表头；4列出试验方案，把各列表头排上培养基组分，对应的水平数字换上个组分的实际水平，每一行就构成一个处理；5根据试验内同，制备培养基，重复样为3~5个。最佳培养基组成123A-KClB-NaClC-大米粉11（0.5）1（0.4）1（9）21（0.5）2（0.6）2（11）31（0.5）3（0.8）3（13）42（0.7）1（0.4）2（11）52（0.7）2（0.6）3（13）62（0.7）3（0.8）1（9）73（0.9）1（0.4）3（13）83（0.9）2（0.6）1（9）93（0.9）3（0.8）2（11）

正交试验方案灰黄霉素产生菌D-756培养基11（0.5）1（0.4）1（9）13258134902674821（0.5）2（0.6）2（11）13672141002777231（0.5）3（0.8）3（13）14893149232981642（0.7）1（0.4）2（11）13765139202768552（0.7）2（0.6）3（13）14798146712946962（0.7）3（0.8）1（9）14926150002992673（0.9）1（0.4）3（13）14111144122852383（0.9）2（0.6）1（9）13986140252801193（0.9）3（0.8）2（11）152701508930359K1843368295684685∑258309K2870808525285816K3868939