3-4基因工程制药

泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳二、外源基因在大肠杆菌中的表达泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳（六）基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳Fn:质粒保持率表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值；α:质粒丢失菌株与质粒保持率菌株μ的比值。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列表现形式:结构不稳定性:重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其生物学功能的丧失分配不稳定性:整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）宿主细胞突变泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳1.缺失突变引起的质粒不稳定性:现已观察到在许多质粒DNA中存在着自发缺失的现象；人工构建的具有多个串联启动子的质粒载体特别容易发生缺失作用。*2.重组作用引起的质粒不稳定性:①一方面存在质粒载体位点之间的同源重组；②另一方面大肠杆菌寄主染色体与质粒载体上的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。这是由于通过IS序列和转位因子的插入作用、邻位缺失或DNA倒位，都有可能使质粒载体产生自发突变。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳由质粒不平均的缺陷性分配(defectivepartitioning)所造成的质粒丢失现象,叫做质粒分离的不稳定性。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢:能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应:关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配:这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组质粒的逃逸率当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有:高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏受体细胞中的核酸酶降解重组质粒:重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒减少拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳改善基因工程菌不稳定性的策略改进载体受体系统以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括:将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因）泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳改善基因工程菌不稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记,向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素根据载体上的营养缺陷型标记,向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂,成本较高泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳改善基因工程菌不稳定性的策略两阶段培养法:第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。控制目的基因的过量表达:可控型启动子、可控型复制子优化基因工程菌的培养工艺培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度:较低的培养温度有利于重组质粒的稳定固定化泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳

（七）利用重组大肠杆菌生产人胰岛素胰岛素的结构及其生物合成人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳胰岛素的结构及其生物合成NC肽（31）NCSSSSCN高尔基体内的特异性肽酶SSSSCSSA肽（21）RRKRN信号肽B肽C肽A肽信号肽酶SS泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法:直接提取法制人胰岛素早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。人胰岛素的生产方法泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素A链和B链的序列,由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的,但其生产成本奇高,从而也限制了产品的广泛应用。人胰岛素的生产方法泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳化学转型法制人胰岛素猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。上述思路的技术路线是:在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。人胰岛素的生产方法泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳基因工程法制人胰岛素1982年,美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素,成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年,Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别,而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点,充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。人胰岛素的生产方法泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法基因工程菌的构建战略化学合成A链和B链的编码序列tacb-GalBpeptideoriAprMetMetMMNCMNtacb-GalApeptideoriAprMetMetMC泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法表达产物的后处理路线:MMNCb-GalAMMNCb-GalBCNBr

处理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys

体外氧化和重折叠分离纯化泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法生产技术的评价:由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达180美元以上。为了进一步降低生产成本，美国ElyLiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略:tacb-GaloriAprMetMetBpeptideApeptide人胰岛素原的cDNAMMNC重组人胰岛素原转化分离纯化泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳SSSSSSNCR胰蛋白酶CNBrCNCpeptideMRRKRRKSSSSCNSS羧肽酶B重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法表达产物的后处理路线:B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感羧肽酶B胰蛋白酶泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建人胰岛素原表达法生产技术的评价:在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前美国ElyLiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链同时表达法tacb-GaloriAprMetMetMMNCApeptide化学合成AB链编码序列重组人胰岛素分离纯化CNBr

处理特异性裂解体外折叠泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强,但不能分泌,只能以包涵体的形式存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与β-内酰胺酶基因拼接,β-内酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性,为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳作业一、简答1、宿主细胞的选择原则有哪些？2、简述表达载体必需具备的条件。3、简述大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的优缺点。4、简述各种表达系统的类型和特点。5、最佳启动子应具备哪些条件？6.选用强终止子的必要性有哪些？7、核糖体结合位点对外源基因表达的影响有哪些？8、如何根据密码子偏爱性使外源基因在大肠杆菌细胞中高效表达？9、大肠杆菌异源蛋白的表达类型及特点有哪些？10、简述基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制。11、改善基因工程菌不稳定性的策略有哪些？12、基因工程法制人胰岛素的技术路线有那几条？二、名词包涵体、宏观逃逸率、补料分批培养、透析培养、固定化培养、连续培养、高密度培养泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳第八节基因工程菌的培养工程菌的培养过程：摇瓶操作（温度、pH、培养基组分、碳氮比）；培养罐操作（确定培养参数、控制方案、顺序）一、基因工程菌的培养方式1.补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。通常把溶氧控制与流加补料结合起来进行。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2、连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。3、透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去处培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4.固定化培养：将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养

原料发酵培养基配制灭菌发酵生产代谢产物分离

微生物工业发酵过程简图泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳1.培养基的影响使用不同的碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。如以甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳源菌体产生的副产物较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用,采用流加措施,控制培养液中葡萄糖的较低浓度,可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。还有无机磷对产物的影响也较大。碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等。二、基因工程菌的发酵工艺泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2、接种量的影响接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。它的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达，采用大接种量，由于种子液中含有大量水解酶，有利于对基质的利用，但接种量过大往往会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。3.温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成水平上。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数,对菌体的生长和产物的生成影响很大。维持较高水平的DO2值（>40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋白产物的形成。在诱导表达期间,要维持外源基因的高水平转录和翻译,细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值,不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。4.溶解氧的影响泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳5.诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间:加入诱导剂后的培养时间。随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间酶活力酶表达水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳6.诱导时机对表达的影响诱导时机指加入诱导剂的时间以天冬酰氨酶表达为例,见表。A600=0.295*10时生长速度比较快,这时菌体进入诱导状态,酶蛋白的积累加快,酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期,由于发酵液中营养的消耗,及代谢产物的积累,使菌体的生长速度受到抑制。在此状态下诱导,表达显然受到影响。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳诱导时机对酶表达水平和活力的影响生物量（A600）

酶活力酶表达水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶0.0340.1110.0650.070.0650.050.04泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳7、pH值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下,pH值对不同菌群生长影响不大,而对外源蛋白表达有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培养工艺,前期为菌体生长阶段,后期为蛋白诱导表达阶段。细胞生长期的最佳pH范围在6.8-7.4,外源蛋白表达的最佳pH为6.0-6.5。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳三、基因工程菌的培养设备发酵罐作为基因重组体的培养装置,与一直沿用的通气搅拌培养罐要有区别,即不仅要防止外部微生物侵入罐内,还必须采用不使培养物外漏的培养装置。按实验准则,可把这类密闭型通气搅拌式培养罐划分为操作液量20L以上和20L以下两种。应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵,微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物,细胞生长并非主要目标,而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳发酵罐的组成有:发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统对发酵罐要求:提供菌体生长最适生长条件；培养过程不得污染；保证纯菌培养；培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳第九节高密度发酵HCDC（high-celldensitycultivation）HCDC的定义、优势HCDC的主要限制因素及解决方法HCDC的生物反应器HCDC的补料策略泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳1.1高密度培养的定义高密度培养:是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，目前最高菌体密度为200g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。随着基因工程技术的发展和应用,构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作,同时也便于基因工程改造。其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳1.2高密度培养的优势提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率缩小生物反应器体积,降低设备投资缩短发酵周期,减少水电使用,降低生产成本便于下游分离纯化工艺等。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2.HCDC的主要限制因素固态或挥发性底物在液态培养基中溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累对细胞生长产生限制呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2.1培养基高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分,配比均衡,且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。一般采用营养成分清晰的全合成培养基,便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度,并结合恰当的流加补料策略提供营养物质,使细胞生长维持在最佳状态。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2.2培养温度培养温度随菌种、培养基成分和细胞生长阶段的不同而不同,温度不仅影响发酵液的理化性质,还对外源蛋白的表达和活性有很大的影响。细胞密度较高时,呼吸作用释放大量热量导致发酵液的温度升高,因此发酵设备需要快速有效的降温散热系统。温度还可作为高密度发酵的调控手段泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳温度的调控目前主要的控温策略是手动调节冷却水的流量针对不同的发酵过程，罐温控制方式也不相同。大致分为两类（据发酵过程中最适温度是否变化）:定值控制程序设定控制（例如:自适应PID等）泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2.3pH发酵体系pH值是发酵液成分与细胞代谢综合作用的结果。C源消耗而产生的有机酸,CO2的溶解,补料的流加,次级代谢产物的积累,菌体自溶裂解等都可导致pH的变化。pH不仅是反映细胞生长代谢的指标,也是调控高密度培养的手段泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳pH调节pH的调节需要从发酵初始培养基开始，初始pH不同，最终发酵效果可能也会有很大差异。发酵过程中pH的调节，可分为两种：内源性调节：过程中通过补加C.N源调节（C源经代谢产酸使pH降低；供能不足时，N源的C骨架作为能源参与代谢，产生NH+4,使pH升高）外源性调节：流加酸（H3PO4）碱（氨水）调节。氨水还可以作为N源。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2.4溶解氧（DO）溶解氧(DO)浓度很大程度上影响细胞生长及外源蛋白的表达。DO浓度随菌体密度的增加和呼吸作用的增强而降低,发酵液黏度增加也会影响氧传递的速率。DO浓度一旦低于临界氧浓度值,细胞停止生长,甚至死亡。泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳溶解氧的调节物理方法调节:增加空气流量，提高搅拌转速；增大罐压；通入纯氧（混合不均，易养中毒）化学方法调节:加入H2O2（利用菌体产生的过氧化氢酶促使其分解产生O2）生物改造方法:在菌体中克隆具有提高养传递能力的透明颤藻蛋白（VHB）泰山学院生物工程与酿酒学院生物技术制药朱红艳2.5比生长速度比生长速率（μ=（dN/dT）/N）是高密度培养过程中最重要的过程参数,它影响细胞对营养成分的吸收和分配、细胞的生长、外源蛋白的表达与折叠、核糖体的浓度、RNA的浓度和副产物的生成与积累等一般认为大肠杆菌的比生长速率控制在0.1-0.3h-1之间较合适,能较好地避免或减少副产物乙酸的生成。但比生长速率也应根据菌