分子生物学常用技术下

.分子生物学常用技术.NCBI/Blast/Nucleotideblast1.核酸的分离纯化和鉴定:基因组DNA.总RNA.质粒2.基因的克隆与鉴定方法待查序列....3.外源基因转移技术和表达体系4.检测方法：电泳技术：agarose、SDS分子杂交:SB.NB.WB.基因芯片技术DNA序列测定生物信息学分析技术5.基因功能研究的方法6.组学研究技术：基因组学、蛋白质组学.三、外源基因转移技术和表达体系1.外源基因转入技术细菌:热激法，电转化热激法转化试剂配制：？LB培养液LB-Amp平板LB-Kan平板a.加入连接产物/质粒，冰浴b.42℃90sec，冰浴c.培养:LB培养液d.涂板.生物学方法:农杆菌介导的基因转导花粉管通道法介导的基因转化体外包装转染法共转化生殖细胞浸泡法介导的基因转化化学方法:PEG介导的基因转化磷酸钙沉淀法真核细胞.生物化学方法:脂质体法:Kit生物物理方法:胚胎干细胞法电转化法:电转仪物理学方法:基因枪法显微注射介导基因转化胚囊、子房注射法介导基因转化激光微束介导基因转化超声波介导基因转化碳化硅纤维介导法.2.原核细胞表达体系:大肠杆菌优点:遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强和适用范围广。缺点:表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、高表达时容易发生折叠错误、Ecoli本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。成功例子:β-干扰素.组成

启动子：lac、trp、tac、PL启动子目的基因编码序列终止子：受体细胞表达载体表达方式非融合蛋白：pBV220融合蛋白分泌表达:含有信号肽序列，OmpA等带纯化标签的表达：GST、His6表面呈现表达带伴侣的表达：GroEL、GroES等分离纯化:亲和层析.重组蛋白的制备:细菌重组表达载体Ni-亲和胶GST-亲和胶表达形式分析：可溶性/包涵体亲和纯化宿主菌:BL21转化重组蛋白表达：SDS诱导剂重组蛋白WB鉴定.3.真核细胞表达体系(1)酵母表达体系毕赤酵母表达体系:表达水平高(外源蛋白占菌体总蛋白10-30%)，异源蛋白的表达有胞内和分泌两种形式。工艺成熟，分离纯化简单，糖基化方式更接近高等生物。成功例子:乙型肝炎病毒表面抗原酿酒酵母表达体系:遗传背景清楚，容易操作，但表达的重组蛋白产量偏低(外源蛋白占菌体总蛋白10%)，且会被超糖基化。有胞内表达和分泌性表达两种，只有分泌性表达的蛋白质才能被糖基化。成功例子:水蛭素.(2)昆虫细胞杆状病毒表达体系杆状病毒主要感染昆虫，利用昆虫细胞生产重组蛋白。受体细胞:草地夜蛾细胞株sf9和sf21。优点:昆虫和哺乳动物细胞的翻译后加工方式相似，重组蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白相似，表达水平较高(发酵液中目的产物含量1-500mg/L)。缺点:糖基化程度较低，形式较为单一。.(3)哺乳动物细胞表达体系调控序列启动子:SV40、RSV、ADV、CMV、HSP、MCK终止子:SV40小t抗原基因、β珠蛋白基因、牛生长激素基因的转录终止信号。选择性标记基因:TK、APH、dhfr、XGPRT可调控表达体系:Tet-on和Tet-off体系pERV3和pEGSH诱导体系宿主细胞:CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3、HEK293等.优点:产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等翻译后加工最准确。缺点:表达水平低，发酵液中目的产物我国为0.2~1g/L，国际上多在1~2g/L以上。2007年,全球销售额最高的6大类生物技术药物中,有五类(肿瘤治疗药物、anti-TNF

α药物、EPO、胰岛素和凝血因子)都是经哺乳动物细胞表达生产的。动物细胞大规模培养是当前生物药物生产的主流方式。.四、检测方法1.电泳技术核酸:完整性、分离、纯化琼脂糖凝胶电泳:agarose,水平,1XTAEEB(2ng),Gelred,Goldview,紫外灯试剂配制：？50XTAE..图PCR产物电泳结果1.DNA相对分子质量DL2000;2.PCR产物;3.PCR空白对照。.聚丙烯酰胺凝胶电泳:PAGE(Acr+Bis)垂直,银盐染色非变性/变性.蛋白质:SDS.1.试剂配制：？30%丙烯酰胺-N,N亚甲双丙烯酰胺1.5MpH8.8Tris-HCl1MpH6.8Tris-HCl10%SDS10%过硫酸铵电泳缓冲液：25mMTris-HCl(pH8.0),250mMGly,0.1%SDS(pH8.3)4X电泳加样缓冲液考马斯亮蓝染色液脱色液2.浓缩胶和分离胶配制表：？10%分离胶.1.配胶:分离胶浓度，胶凝时间，储存2.上样:30μl/次/道3.电泳:90V120V4.染色5.脱色步骤:.1948年诺贝尔化学奖ArneWilhelmKaurinTiselius“发展了电泳和吸收分析等方法,发现了血清蛋白的组分”电泳、色谱、相分离、凝胶过滤.(1)原理:变性和复性2.核酸分子杂交碱基互补配对两条核酸单链(同源性)退火双链条件(温度及离子).(2)探针概念:特定的已知核苷酸片段,能与互补核酸序列退火杂交,用于待测核酸样品中特定核酸顺序的检测..种类

基因组DNA:外显子

cDNA:理想，非特异性少，获得困难

cRNA：理想，杂合体稳定，杂交温度高杂交效率高非特异性少寡核苷酸片段：15-30bp，杂交时间短.标记物特性高度灵敏性不影响碱基配对不影响探针分子的主要理化特性使用酶促方法时,不影响酶活性检测方法的灵敏性和特异性高化学稳定性高操作的安全性.放射性同位素:32P,3H,35S非放射性标记物:生物素、地高辛、荧光素.标记方法内标记末端标记

切口平移法随机引物法单链DNA探针cRNA探针标记.切口平移法:dsDNA，掺入率高，最常用[α-32P]dATP37℃15min限速步骤37℃2～3h.dsDNA+随机引物变性:沸水3min冰浴:1minKlenow大片段:RT≤3h5’3’聚合酶活性3’5’外切酶活性[α-32P]dATP随机引物法:dsDNA，掺入率高，常用.单链DNA探针标记:M13噬菌体的DNA片段标记.dsDNA3’端GAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG+EcoRⅠ方法1:内切酶切出粘末端＋Klenow大片段适当种类的[α-32P]dNTP末端标记:.方法2:3’端填充标记法T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、Klenow片段dNTP-:3’5’外切酶dNTP+:5’3’聚合酶.5’末端：T4多核苷酸激酶(T4PNK)，DNA.RNA[γ-32P]dATP5’-OH末端寡核苷酸的磷酸化磷酸基团的交换.纯化凝胶过滤层析:SephadexG-50乙醇沉淀法.液相杂交:待检物在液体中，速度快，与核酸电镜技术结合在一起，研究不同DNA的同源性mRNA与染色体DNA间的关系固相杂交:待检物在一定支持物上，检测方便，应用广泛。膜固相印迹杂交细胞原位杂交(3)分类.固相支持物结合核酸类型ssDNAssDNAssDNARNAdsDNAdsDNARNARNA荷载能力(μg/cm2)80~100400~600400~600膜强度差好好结合核酸的方式非共价结合共价结合共价结合结合核酸最小长度500nt50nt/bp50nt/bp固定方法80℃烘烤2h80℃烘烤2h80℃烘烤2h

或紫外交联或紫外交联

硝酸纤维素膜普通尼龙膜带正电荷尼龙膜.固相杂交Southern-blotNorthern-blotDot-blot原位杂交菌落原位杂交.(4)过程检测核酸(单链或双链)固定在膜上(双链变性为单链)探针的制备和标记预杂交封闭膜上的非特异结合位点降低杂交本底杂交杂交温度和离子强度洗膜离子强度和温度洗去非特异性结合的探针放射自显影化学显色法.SouthernblotdsDNA内切酶dsDNA片段-+电泳+************标记的探针*******杂交转膜**放射自显影洗膜.印迹方法:毛细管转移法、电转移法和真空转移法.Bio-Rad电转仪.Agarose电泳SouthernblotNorthernblot基因组DNA总RNA限制性内切酶尼龙膜甲醛变性电泳变性PAGE基因酶切图谱基因组基因定性及定量基因突变探针特定RNA定性定量大小探针

转移NaOH滤膜再次使用.Southern印迹杂交1、处理样品2、凝胶电泳及转移前处理3、核酸转移及固定4、预杂交5、杂交6.洗膜7、杂交结果的检测8、杂交膜的重复使用.1实验准备:创造一个无RNA酶的环境2制备凝胶3样品的处理:在杂交之前，应该确定所用的核酸样品具有相当的纯度和完整性4RNA电泳及转移5核酸的固定、预杂交、杂交、洗膜及杂交结果的检测均同Southern印迹杂交Northern印迹杂交.斑点杂交与狭缝杂交

概念:将DNA或RNA样本变性后直接点于膜上,用于基因组中特定基因表达的定性和定量分析,简单快速,一张膜可同时检测多个样本。.组织或细胞经适当处理后,细胞通透性增加,探针能与细胞内DNA或RNA杂交,可以确定探针互补序列在胞内位置,具有重要的生物学和病理学意义。原位杂交:.菌落的原位杂交:筛选含有阳性重组子的菌落。菌落转印到膜上原位溶菌和变性杂交.蛋白质杂交:WB.1.样品处理:RIPA裂解，超声，离心，总蛋白浓度2.SDS:分离胶浓度3.转膜:-滤纸-胶-NC膜-滤纸+，条件4.丽春红染色:丽春红5.封闭:5％脱脂奶粉-TBST，RT1h摇床6.Ab1:1:50~1:3000(封闭液)，RT1h/4℃过夜7.洗膜:TBST，RT1h，换液，摇床8.Ab2:1:3000(封闭液)，RT40min，摇床9.洗膜:同前10.ECL显色:RT5min，暗室，X-光片.生物芯片:包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片三类芯片:在有限的材料表面固定大量的样品，一次试验可对很多的基因或蛋白进行检测。基因芯片:又称DNA微阵列或DNA芯片，是在基片上面积很小的区域内有序地固定大量的基因探针组成。种类:寡核苷酸芯片和cDNA芯片制备方法:直接点样法:寡核苷酸芯片和cDNA芯片原位合成法:寡核苷酸芯片.基因芯片a.探针(DNA或cDNA)固定:以高密度点阵的形式按一定顺序固定排列在硅片(玻片、尼龙膜等)表面上b.待测样品标记:DNA.RNA或cDNA用荧光标记c.杂交d.检测:读片仪

一次实验，DNA芯片便能记录成千上万的基因表达图谱。..应用:a.基因表达:直接检测mRNA的种类及丰度，是研究基因表达的有力工具。b.基因突变和基因诊断:大规模地筛查由基因突变引起的疾病，辅助疾病的诊断。c.基因测序d.功能基因组研究.3.DNA序列测定化学裂解法:Maxam和Gilbert，1977，可用于补充DNA测序结果，常用于难以用酶末端终止法测序的特殊DNA序列及结构。酶末端终止法:Sanger和Nicklen，1977，又称为双脱氧链终止法。自动化程度高，且在技术上不断进步。如荧光标记DNA测序技术、毛细管测序仪等。全基因组鸟枪测序法:用于大规模基因组测序，不需要预先构建基因组的物理图谱，CeleraGenomics公司用以人类基因组测序。逐个克隆鸟枪测序法:用于大规模基因组测序，需预先构建基因组的物理图谱，人类基因组计划公共联盟采用这个方法用于人类基因组测序。杂交测序:借助于基因芯片.(1)化学裂解法a.先将DNA的末端之一进行标记(32P)；b.在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；c.在修饰碱基位置化学法断开DNA链；d.聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；e.根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列。

.(2)Sanger双脱氧链终止法...PaulBerg

WalterGilbert

FrederickSanger

“在核酸碱基序列测定的贡献”1980年诺贝尔化学奖“在核酸生化,尤其是DNA重组的基础研究”.逐个克隆鸟枪法测序.全基因组鸟枪法测序.(3)杂交测序:是以基因芯片为基础的一种测序方法，将一段DNA片段分解为一系列相差一个碱基的八聚体，将这些八聚体做成基因芯片与待测DNA杂交，根据杂交结果拼凑出所测DNA序列。.4.生物信息学分析技术概念:是生物学和信息技术的结合，利用计算机对大量生物数据进行分析。组成:数据库:数据采集，包括DNA/RNA/蛋白质测序，蛋白质的结构，基因/蛋白质表达数据，蛋白质相互作用数据。算法和统计方法:确定大数据集中各成员的关系对生物数据的分析和解释:生物数据的检索Entrez,NCBI,BLAST.1.动物模型2.蛋白质相互作用3.定点突变技术4.基因表达谱和表型变化线索:生物信息学五、基因功能研究的方法.方法直接转染或用反转录病毒感染胚胎干细胞,然后将这些细胞移植到囊胚发育阶段的胚胎中；b.用反转录病毒感染早期胚胎；c.将包含目的基因的DNA显微注射到卵母细胞、受精卵或早期胚胎细胞中；d.雄配子介导的基因转移；e.将目的基因转移到未受精的卵细胞中；f.通过基因枪和电融合等物理方法进行基因转移。1.转基因动物.2007年诺贝尔生理学或医学奖MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies“发现利用胚胎干细胞在小鼠中引起特定基因修饰的原则”.基因敲除:又称为胚胎干细胞基因打靶技术。动物模型:小鼠，ES细胞核型为40XY打靶载体:置换型和插入型数据库:1995年建立MKMD(MouseKnockout&MutationDatabase)/mkmd.鉴别纯合的基因敲除动物打靶载体的构建ES细胞的体外培养将打靶载体导入ES细胞通过抗性标记筛选目的基因已被破坏的干细胞克隆基因敲除ES细胞的胚胎移植镶嵌个体与正常纯合个体杂交鉴别出的杂合体后代相互杂交.外源基因过表达:将外源基因的载体注入受精卵细胞筛选带有外源基因的个体带有外源基因的个体杂交,以保持性状受精卵移入带孕小鼠.概念:真核生物中，双链RNA诱导产生特异性基因沉默的现象。是一种序列特异性的转录后基因沉默过程，它通过双链RNA分子引起具有相同序列的mRNA发生降解来关闭基因表达活性，能够产生功能缺失表型，是功能基因组学研究的重要工具。生物学意义:遗传监视器监控异常的或外源遗传物质在机体内的水平，调控基因的表达

2.RNA干涉:RNAinterference,RNAi..2006年诺贝尔生理学或医学奖AndrewZ.FireCraigC.Mello“发现RNA干涉作用双链RNA引起的基因沉默”.机制dsRNA的形成短干扰RNA的产生靶mRNA的降解.靶序列的选择:a.基因外显子编码区的dsRNA能产生特异和高效的抑制作用，对应于内含子序列的dsRNA不能产生可检测的抑制效应。b.在构建载体时，应选择cDNA分子中的可读框序列c.避免起始密码子下游和终止密码子上游50～100nt范围内序列d.避开多个串联的G、T或A碱基的区域e.GC含量应该小于50％f.与其他基因无同源性g.同时构建两个以上对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体.方法化学合成。体外转录。RNaseIII家族的酶（例如:Dicer，RNaseIII）切割长链dsRNA。用PCR法合成siRNA表达结构，并在细胞中表达。向细胞中导入可表达siRNA的质粒载体或病毒载体，并使之表达。向细胞中转染siRNA..步骤:a.设计并合成siRNA;b.利用脂质体将siRNA导入细胞c.具有相同序列的mRNA降解d.细胞或个体不能合成相应的蛋白质，表现出功能缺失表型检测:RT-PCR，WB对照:阴性，阳性，空白.3.反义核酸技术:根据核酸杂交原理设计的选择性抑制特定基因表达的实验技术。1)种类：反义DNA(oligodeoxymucleotide,ODNs)、反义RNA.核酶（ribozyme)、DNAzyme2)生物学作用：抑制靶基因的表达3)设计：随机筛选靶点4)长度:15~20nt.5)机理:空间位阻:与mRNA或DNA双链形成的RNA/DNA杂交体激活RNaseH活性阻止mRNA的拼接阻止靶基因的复制或转录6)修饰改变立体构型:由天然的β型糖苷键改为α型化学修饰:即ODNs磷酸糖骨架的磷酸二酯键被一些化学基因取代ODNs末端修饰肽核酸.7)问题非反义效应靶mRNA的不可接近性反义核酸进入细胞后可与其它分子如蛋白相互作用，可能引起一系列的副作用RNaseH作用特性的影响反义核酸的剂量-效应曲线局限的范围非常窄8)应用前景:反义药物，基因功能研究.4.蛋白质的相互作用基于文库筛选的方法:酵母双杂交、表面展示技术生物物理方法:免疫共沉淀、蛋白质亲和层析、交联技术和荧光共振能量转移技术遗传学方法:基因外抑制子、合成致死筛选.(1)酵母双杂交:通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质。LexA=BD+AD.步骤:a.构建诱饵质粒诱饵基因亚克隆至BD表达载体诱饵蛋白在酵母中表达的鉴定:Western-blot诱饵质粒自激活作用的检测b.构建至AD表达载体cDNA文库的扩增:库容108c.筛库:将重组BD和AD质粒分别或同时转染酵母报告菌株，利用报告基因筛选阳性克隆d.PCR反应鉴定e.测序f.蛋白相互作用的验证:g.功能研究体系：Gal4(最常用)、LexA/Gal4.LexA/VP16.优点:高敏感性，适用于细胞核内外多种蛋白质之间相互作用的研究。缺点:a.不适宜于转录因子相互作用蛋白质的筛选b.酵母细胞中蛋白质翻译后修饰比较简单c.通过酵母双杂交筛选获得的多为EST片段d.存在假阳性与假阴性的问题.应用根据研究目的可分为三类:a.明确两种已知蛋白之间有无相互作用；b.鉴定已明确有相互作用的蛋白质发生相互作用所必须的功能域以及特定氨基酸的改变对相互作用的影响；c.寻找与某一特定蛋白质有相互作用的未知蛋白.其他杂交体系反向杂交体系:蛋白质相互作用－报告基因产生特殊物质－细胞死亡蛋白质无相互作用－报告基因不产生特是物质－细胞存活应用:鉴别不同突变对蛋白质相互作用的影响，筛选阻止某些蛋白质相互作用的肽或小分子物质单杂交体系:研究DNA与蛋白质相互作用，分离能与DNA序列结合的蛋白质的基因.RNA蛋白质小分子蛋白质三杂交体系:研究RNA与蛋白质之间相互作用关系以及小分子与蛋白质相互作用关系。.(2)表面展示技术噬菌体表面展示技术:最常用，在噬菌体颗粒的表面通过衣壳蛋白定位表达与之融合的外源蛋白质或多肽，可用于筛选和改造功能性多肽，研究基因功能。酵母表面展示技术:通过将酵母自身分泌到细胞外的蛋白质编码基因与外源蛋白质基因融合，将外源蛋白质展示于酵母表面，用于筛选具有高亲和力的多肽。动物病毒展示技术核糖体展示技术.(3)免疫共沉淀技术:概念:是分析确定生理条件下完整细胞内两种蛋白质是否存在相互作用的有效方法。原理:是利用标签抗体与融合蛋白携带的标签之间的高亲和力特性纯化和检出溶液中的靶分子。注意:抗原的丰度抗体对抗原的亲和力，最好选用单抗。免疫共沉淀:真核细胞

X-HA+Y-myc共转染Cos7/293细胞

IP:HAIB:mycIP:mycIB:HA共定位:真核细胞X-GFP+Y-RFP共转染Cos7/293细胞，荧光显微镜.EMSA(electromobilityshiftassay):蛋白质-DNA间的相互作用将DNA进行放射性标记(<50bp)与细胞/细胞核提取物反应非变性PAGE与蛋白质结合的DNA迁移率降低问题:蛋白质是否与DNA结合?.(4)蛋白质亲和层析技术:将特定蛋白质固定于固相载体上用于吸附能与之特异性结合的蛋白质，用于蛋白质的纯化和推测功能未知目的蛋白的功能。CIPM66.2kDHis6-TRF1可溶性.(5)抗原表位的鉴定与分析方法抗原和抗体的识别与结合是最典型的蛋白质之间的相互作用对位:指抗体参与结合的部位表位:指抗原参与结合的部位鉴定方法:计算机软件对抗原氨基酸序列的结构分析，准确率达75％，包括亲水性、可及性、抗原性、可塑性、电荷分布和二级结构预测分析。实验方法:酶促/化学裂解片段分析法、蛋白质印迹法、肽扫描、表面呈现肽库/随机片段表达库筛选、化学修饰/突变分析、X射线衍射、表面等离子共振和核磁共振等。应用:合成多肽疫苗、制备诊断试剂和筛选高效价抗体；利用定点突变技术改造蛋白质结构以降低蛋白质药物免疫原性。.5.基因表达谱和表型变化基因表达差异蛋白质水平:双向凝胶电泳和质谱技术基因芯片技术(主流)代表性差异分析抑制性减法杂交技术mRNA减法杂交技术基因表达系列分析法基因组错配筛选技术。表型变化抑制基因的表达:反义寡核苷酸、核酶、负显性突变体、转基因、RNAi增强基因表达:即功能增益，增加基因拷贝数或采用强启动子促使基因过量表达。RNA水平.六、组学研究技术1.基因组学转录组分析:即mRNA的定性和定量分析，分类: