DB22T 2010-2014 家畜(猪牛羊)戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法

备案号：41804-2014DB22DB22/T2010—2014家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法DetectionofHepatitisEvirusbyRT-PCRinLivestock（pig/cattle/sheep）吉林省质量技术监督局发布12GB/T6682分析实验室用水规格和试验戊型肝炎病毒科成员。一种单股正链RNA病毒，呈球形、直径27～34nm，无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。病毒基因组长约7.2knt，有3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF聚合酶链反应polymerasechainreaction[PCR]反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应反转录reversetranscription[RT]35'-AAATYAATTCTGTCGGR注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/CDNA分子质量标准可采用100bpDNAladderMaker、DNAMarkerDL2000或其它等效产）：45.5高速台式冷冻离心机：1200挑取0.5g~1.0g粪便样品于1.5mL离心管内，加入灭菌的1mol/LPBS溶液，旋涡震荡混匀，制备成10%的粪便悬液，4℃8000r/min离心10mi取上述处理好的样品100µL于1.5mL无RNA酶离心管中，每管加入1000µLTrizol试剂，混匀，室温放置5min；加入200µL氯仿，混匀，室温放置5m以下保存，尽快使用。本操作应在一个无RNA酶（Rnase）的条5）：加完试剂后瞬时离心混匀。72℃5min，冰浴）：反应总体积为25µL。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应：42℃反应1h；然后95℃灭活反转录酶存备用。本加样操作应在一个无RNA酶（Rnase）的条在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别）：）：）：）：）：6彻底延伸10min；4℃保存。PCR产物可直接将凝胶托架水平放置在工作台上，并放上梳子。称取1.0g琼脂糖于三角烧瓶中，加入100mL1倍Tris-硼酸电泳缓冲液，用微波炉加热溶解琼乙锭（EB）溶液5µL，使其终浓度为0.5μg/mL，充分8.1将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪或凝胶成7）：将0.1mLDEPC加入100mL双蒸水中配成0.1%的水溶液，室或在室温下磁力搅拌20min，然后1.034×105Pa高压灭菌30min，室温保存。DE致癌物，开瓶取用时应使瓶子尽可能小心谨慎，避免溶液因内部压力）：在100mL双蒸水中加入1.0g溴化乙锭（EB用铝解，然后移至棕色瓶中，保存于室温。溴化乙锭（EB）是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料——蔗糖：40.0g；）：8A.5.10.5mol/LEDTA（pH8.0）的配制）：——双蒸水：定容至1000mL；在800mL双蒸水中加入186.1gEDTA-Na2pH值至8.0（约需20.0g氢氧化钠颗粒），然后定容至1000mL，分装后1.034×105Pa高压灭菌30室温保存。——硼酸：27.5g；）：——氯化钠：8.0g；——氯化钾：0.2g；9tacatggatcacctgtgaattcttacactaatacaccttacactggtgctctcggcctgctcgatttgcgcttgagcttgagttcgtaatctacacggtttatg