微生物检测技术

微生物检测技术1目

录123456金黄色和白色葡萄球菌类白喉杆菌八叠球菌变形杆菌真菌大杆◆保证实验操作中样品不被环境或人员所携带的微生物所污染◆防止样品所携带的微生物污染实验环境、感染操作人员不暴露头发不暴露口鼻不暴露躯干皮肤一般皮肤常见菌三不漏原则无菌操作目的②

操作人员进入无菌室前应先关掉紫外灯。③

工作人员进入前需洗净双手，必须在缓冲间换洁净区的工作服、帽子、口罩和工作鞋(无工作鞋必须戴鞋套)，

然后风淋30秒后方可进入无菌室。④

已消毒灭菌的器皿、培养基应通过传递窗送入无菌室，样品也应通过传递窗传递，前后两者分开传递且传递时双

门不得同时打开。⑤

已灭菌的培养基或平皿：

放入传递窗后，打开紫外灯照射1~2分钟，对物体表面消毒后方可送入无菌。⑥

样品(箱体外包装拆除)

：表面用75%酒精擦拭消毒，放入传递窗，待酒精挥发干后，方可进入无菌室。⑦

无菌操作前，用75%乙醇溶液消毒桌面及双手。⑧

在操作过程中，若污染了桌面、地面、衣服等，应及时使用75%乙醇溶液进行消毒处理。⑨

测试完毕后，将需培养的平板和培养物从培养室的传递窗传出进行培养。操作人员必须将净化台面和净化台面周

围的杂物收拾干净。⑩

全天实验完毕后应对实验室和传递窗进行消毒剂消毒，消毒剂可用75%乙醇溶液或84消毒液。若当天实验涉及芽

孢菌测试，使用二氧化氯消毒剂进行清洁消毒。⑪

消毒完成后应至少打开紫外灯辐照灭菌30分钟，

若有必要可将无菌室的紫外灯过夜灭菌。具体程序①

在进入无菌室前打开无菌室、缓冲间和传递窗的紫外灯，

以紫外灯照射至少30分钟。

(过夜)无菌操作定义与目的通过一定的实验方法测定食品中的微生物，特别是致病微生物的数量、种类、性质，从而判断食品的卫生质量，保证消费者的身体健康。微生物检验的目的通常是作为做出某项决定或判断。采集样品的目的不明确，则不该对改样品进行分析。实验目的应该在实验进行之前确定。在食品安全管理范围内实验目的一般分为四类：✓确定安全性✓确定是否符合良好卫生规范(GHPs)✓确定食品或具有特定用途成分的效用✓预测产品的稳定性食品微生物检验内容菌落总数测定卫生指标菌检验大肠菌群数测定致病菌检验霉菌、酵母菌数测定产毒霉菌检验霉菌毒素测定食品微生物检验内容细菌检验真菌检验特点➢具有法规性➢检验的范围广➢杂菌含量多，要检验的菌少，需要增菌，抑制杂菌➢检验结果具有数量界限➢需要采样后尽快检验，快出结果意义检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成经济损失。食品微生物检验内容菌落总数测定大肠菌群测定沙门氏菌检验志贺氏菌检验金黄色葡萄球菌检验溶血性链球菌检验副溶血性弧菌致泄大肠埃希氏菌✓食品加工原料的污染✓产、储、运、销过程中的细菌污染✓从业人员的污染✓食品加工过程中的污染细菌污染

食品的途径食品微生物检验内容-食品卫生细菌常规检验项目卫生指标菌致病菌样品种类◆大样：一整批样品(数量不固定)。◆中样：从大样的不同部位取得的混合样品。◆小样：从中样取的、供检验用的样品。◆所采集的样品必须有代表性。在采样前应对食品的原料加工方法运输保藏条件及销售中的各个环节等进行调查。在调查的基础上采集有代表性的样品。样品的采集处理及送检采样原则◆在无菌操作下进行。◆采样用具必须是无菌的。◆所用容器不得含有任何消毒剂、防腐剂抗生素等杀菌或抑菌物质。◆根据样品的种类如袋、瓶、罐装者，应采取完整未开封的，若样品包装过大，则用无菌采样器采样。样品为固

体粉沫，应边取边混合；为液体，振摇均匀后再取样；为冷冻食品，采样后应保持在冷冻状态；非冷冻食品采

样后，应保持在0--5oC(不能冷冻).◆按规定采样数量及方法采集样品量(采样方案分为二级和

三级采样方案)。◆样品采集后贴好标签、标明品名、来源、数量、地点、

采样者及年月日等必要时可贴封条送检。◆记录采样现场的温度、湿度及卫生状况。样品的采集处理及送检在无菌操作下进行。液体样品✓原包装样品将液体混匀后，用点燃的酒精棉球对瓶口进行消毒灭菌，用石炭酸或来苏儿(煤酚皂液)等浸泡过的纱布盖好瓶口，再用消毒开瓶器开启后直接吸取进行检验。✓含CO2的液体样品(如汽水、啤酒等)可用上述无菌方法开启瓶盖后，将样品倒入无菌磨口瓶中，盖上一块消毒纱布，开一缝隙轻轻摇动，使气体溢出后再进行检验。✓酸性液体食品：按上述无菌操作倒入无菌容器内，再用20%的Na2CO3调节PH值为中性后检验。固体样品：✓用灭菌刀、剪、镊子，取不同部位25克，剪碎，放入灭菌

均质器内或乳钵内，加定量灭菌生理盐水，研碎混匀，制成1：10混悬液。✓不同食品混悬液制法不同：一般食品取25克，加225克灭菌生理盐水使其溶解即可；含盐量较高的食品直接解在灭

菌蒸馏水中；在室温下较难溶解的食品如奶粉、奶油、奶

酪、糖果等样品应先将盐水加热到45oC后放入样品(不能高于45oC

)，促使其溶解；蛋制品可在稀释液瓶中加入少许玻璃珠，振荡使其溶解；生肉及内脏应先将样品放入沸水内煮3--5秒或灼烧表面进行表面灭菌，再用灭菌剪刀剪掉表层，取深度样品25克，剪碎或研碎制成混悬液。样品的采集处理及送检罐头✓对罐头先进行密封实验及膨胀实验，观察是否有漏气或膨胀情况。✓若进行微生物检验，先用酒精棉球擦去油污，然后用点燃的酒精棉球消毒罐口，用来苏水浸泡过的纱布盖上，✓再用灭菌的开罐器打开罐头，除去表面，用灭菌勺或吸管取出中间样品进行检验。调查现场的棉试子涂擦实验✓将涂擦过的棉试子放在定量灭菌生理盐水中，在检验前用力振荡约50次后再进行接种培养。样品的采集处理及送检

◆如果路途遥远，可将不需冷冻的样品保持在1--5oC环境中(如冰壶)。如需保持冷

冻状态，则需保存在泡沫塑料隔热箱内

(箱内有干冰可维持在0oC以下)◆样品送到微生物检验室应越快越好，一般不超过4h。样品的采集处理及送检✓样品经稀释后，使样品悬液中的微生物分散存在，接种一

定量到培养基中，充分混匀。从理论上来说微生物在培养

基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落，

计算菌落数可推出菌体数。✓落总数测定方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落。✓菌落总数测定方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落。✓菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可用于观察细菌在食品中繁殖的动态，从而对被检样品进行卫生

学评价提供依据。卫生指标菌检验-菌落总数测定◆是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1克或1毫升检样中所含细菌

菌落的总数。定

义原

理➢选择好稀释度；➢培养基温度应在46oC

，不能过烫，否则易把细菌烫死；➢培养液中接种菌悬液后，应在半小时内接种培养基(时卫生指标菌检验-菌落总数测定选择2-3个适宜稀释度

各以1毫升量加入灭菌平皿内间太长，某些细菌可自动凝集)培养基和菌悬液必须充作成几个适当倍数的稀释液➢培养基(营养)琼脂必须透明、无杂质；每皿内加入适量琼脂➢固体样品应彻底粉碎；注意事项检

测

流

程36±1oC48±

2h

菌落计数

检样报告分浑匀。✓新鲜粪便中埃希氏菌属占优势。✓大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又包括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全保险系数更大了；✓测定大肠菌群含量表明食品被粪便污染的程度：

如果菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间接表示有肠道致病菌污染的可能性。◆大肠菌群系指一群在37oC24h能发酵乳糖、

产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，

故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。◆食品中大肠菌群数系以每100毫升(克)检样内大肠菌群最可能数(MPN

)表示。✓这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多；✓在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长；✓在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和食品中不能发现；✓对氯的低抗力与肠道致病菌相似；✓检验方法比较简单，易于检出。大肠菌群包括：埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、

克雷

伯氏菌属卫生指标菌检验-大肠菌群的测定定

义选择条件意

义提高大肠菌群检出率措施◆

小于30的液体样品，取原液10ml、1ml和1：10稀释液1ml接种。◆若小管中无气泡应轻轻振摇试管，若有气泡上升也算产气。◆平板上深紫色带金属光泽的和深紫色的菌落都是典型菌落；若没有典型的菌落，红色、粉色菌落也是可疑菌落。◆若平板上无典型菌落，应挑选3--5个红色或粉色的革兰氏阴性

无芽孢杆菌菌落混合接种于乳糖发酵管中。培养基：乳糖胆盐培养基(液体)指示剂：溴甲酚紫✓平板分离培养基：伊红美蓝(EMB

)(固体)酸性条件伊红和美蓝反应生成深紫色带金属光泽的物质✓证实实验(复发酵实验)乳糖发酵管卫生指标菌检验-大肠菌群的测定总结检测方法✓乳糖发酵实验(初发酵实验)

三步九管法某些真菌污染食品，在适宜条件下产生毒素，当人们误食含有毒素的食品后导致中毒。◆内毒素：活菌体死亡裂解后才释放出来,要是革兰氏阴性菌。◆外毒素：菌体在细胞内

合成毒素后菌体不死亡就可把毒素分泌到细胞外部。主要是革兰氏阳性菌.◆类毒素：外毒素中用0.4%的甲醛可脱去毒性，仍可保持原有毒素的抗原性。脱去毒性的毒素就叫类毒素。人们误食了中毒性细菌及其毒素污染的食物后导致中毒。◆感染型食物中毒：人们误食了含有一定数量活的病原菌的食品后，这些病原菌在体内大量生长繁殖而引起中毒。◆毒素型食物中毒：细菌在食物中繁殖产生毒素，人们误食了一定量的含毒素的食品后引起中毒。食物中毒：人们误食有毒微生物、毒素或有毒化学物质污染的食品或其他有毒生物组织，致使食用者产生急性或慢性中毒卫生指标菌检验-致病菌的测定真菌性食物中毒化学性食物中毒细菌性食物中毒有毒动植物组织◆形态与染色革兰氏染色阴性短杆菌，无芽孢，周生鞭毛，有动力，但有无动力的变种。◆培养特性兼性厌氧，最适生长温度37oC

，最适PH值为6.8--7.8，营养要求不高，营养琼脂上就能生长，培养24h形成菌落为中等大小，直径约2--3mm

，圆形或卵圆形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐或锯齿状菌落，

在液体培养基中呈均匀浑浊生长。卫生指标菌检验-致病菌的测定◆属肠杆菌科沙门氏菌属分6个亚属：I、II、III

(亚利桑那菌属)、IV、V、VI生物学特征分类沙门氏菌预增菌选择性增菌增菌选择性平板分离生化试验血清学鉴定血清学分型(选做)ONPG-

TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素(pH7.2)，KCN卫生指标菌检验-致病菌的测定H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+沙门氏菌，血清学试验XLD

(或HE

、显色培养基)H2S+靛基质+

尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-BS36℃±1℃，40h~48

h36℃±1℃，8h~18h36℃±1℃，18h~24

h42℃±1℃，18

h~24h反应结果与左

侧描述不符25g(mL)样品+225mLBPW商品化生化

鉴定系统36℃±1℃，18h~24

h检测方法1mL+TTB10mL挑取可疑菌落1mL+SC10mL非沙门氏菌样品处理

报告

甘露醇+、山梨醇+菌落为黑色有金属光泽棕褐色，或灰色菌落周围培养基可呈黑色，或棕色有些菌株形成灰绿色的菌落

，周围培养基不变。BS菌落特征卫生指标菌检验-致病菌的测定琼

脂21HE菌落特征卫生指标菌检验-致病菌的测定蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。琼

脂22卫生指标菌检验-致病菌的测定XLD菌落特征，中心菌落呈粉红色带或不带黑色有些菌株可呈现大的带，光泽的黑色中心或呈现全部，黑色的菌落；

有些菌株为黄色菌落带或不带黑色中心23。，6.5.3.将菌液接种到小杯中

2.调制菌液试条放进培养箱度，24h1.分离单个菌落卫生指标菌检验-致病菌的测定API20E7.将反应结果输入数据库软件中根据标准色卡判读反应结果8.菌名软件自动查询报告最符合的附加试剂加进小孔内得到生化谱代码内，4.35371824--血清血鉴定血清学反应：是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，出现肉眼可见的沉淀，凝集现象。多价血

清鉴定卫生指标菌检验-致病菌的测定25◆金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿

润、菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。◆当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验◆形态与颜色：革兰氏阳性球菌，无荚膜。排列成葡萄状。致病性球菌菌体较小，直径约0.5微米◆培养特性：营养要求不高，普通培养基上生长良好，兼性厌氧，最

适生长温度37度，耐盐性强在10-15%的氯化钠培养基中能生长，在肉汤培养基中37度24小时培养后呈均匀浑浊生长，延长培养时间管底出现少量沉淀，轻轻振摇即可消散。在营养琼脂培养基上培养24-48小时后形成圆形凸起边缘整齐表面光滑湿润不透明的菌落，直径为1-2微米。在血平板上致病性的葡萄球菌由于产生溶血素，菌落周围产生透明的溶血圈。皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。◆引起人类疾病的主要为金黄色葡萄球菌。

有些表皮葡萄球菌也致病腐生球菌为非致病菌。卫生指标菌检验-致病菌的测定◆微球菌科葡萄球菌属◆葡萄球菌属分三种：金黄色葡萄球菌，表菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm◆金黄色葡萄球菌

为革兰氏阳性球金黄色葡萄球菌分类生化特性染色镜检

生物学特性26在血琼脂平板上菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5μm—1μm。金黄色葡萄球菌卫生指标菌检验-致病菌的测定27➢36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，

6h之内如呈现凝块即为阳性。➢将试管倾斜或倒置时，呈现凝块或凝固体积大于原体积的一半，

被判定为阳性。关于凝固酶试验结果的判断存在较大争议：倒置试管时呈现凝块，是正确鉴定的必要条件。其余情况只能定为可疑，需要附加核实试验。金黄色葡萄球菌卫生指标菌检验-致病菌的测定血浆凝固酶实验FDA28可引起人的各种感染和食物中毒，潜伏期1-5小时，最短15分钟，很少有超过8小时的。恶心反复呕吐多者可达10余次，一般不发烧或有低烧、发冷，有时腹部疼痛，伴有头晕、头疼、腹泻，1-2天即可恢复，很少有死亡病例。治疗：以保暖输液为主一般不用药物治疗葡萄球菌的抵抗力较强，是不形成芽孢的细菌中最强的。在干燥的浓汁或血液中可存活几个月，加热80度30分钟才可杀死，煮沸可使其迅