《药物分离与纯化技术》课件-第六章VIP

双语在线开放课程药物分离技术DrugSeparationTechnology化学工程学院6.1色谱峰洗脱曲线样液色谱柱检测器馏分信号色谱原理--分离过程三种人参皂苷制备色谱图三种人参皂苷分析色谱图（1）色谱图←色谱峰保留时间（分）基线↓峰高峰宽响应值←色谱峰保留时间（分）基线↓响应值ABCDEO保留时间（分）响应值正常峰前延峰拖尾峰不对称峰对称峰←色谱峰保留时间（分）基线↓峰高峰宽响应值ABCDEO1）峰位---保留时间:进样开始到某组分色谱峰顶点的时间间隔tRDtRAtRBtRCtRE峰高：峰的最高点至基线的垂直距离。峰面积：色谱峰与基线所包围的面积。cdefh2）峰高、峰面积峰高或峰面积操作条件样品浓度进样量检测器灵敏度对于对称的色谱峰

A=1.065hW1/2对于非对称的色谱峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2峰底：峰的起点与终点之间连接的线段距离峰宽：在峰两侧拐点处所作切线与基线相交两点之间的距离半（高）峰宽：通过峰高的中点作平行于基线的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离cdefh1/23）色谱峰的区域宽度高斯峰的特征宽度Wi=拐点处的色谱峰度W1/2h—半峰宽Wb—峰宽

用来衡量色谱峰区域宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差(

)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半或是正态分布曲线上两拐点间距离的一半。（2）半峰宽(W１／２h)：色谱峰高一半处的宽度W１／２h

=2.353

（3）峰宽(Wb)：Wb=4

（2）分配系数比（

）分离因子（也称为选择性因子）也可用来衡量两物质的分离程度，用α表示。分配系数K、容量因子k与分配系数比α的关系

分配系数、容量因子与保留时间的关系

分配系数（或容量因子）越小，组分的迁移速度越快，保留时间越短，即先流出色谱柱；反之亦然。α=1组分不能分离；α组分分离很好。

分配系数（或容量因子）的差异是组分分离的前提。色谱分离中的四种典型情况：①分离效果差，选择性（

）差，柱效低，峰宽②基本分离，选择性（

）差，柱效高，峰窄③完全分离，选择性（

）好，柱效低，峰宽④完全分离，选择性（

）好，柱效高，峰窄（3）分离参数分离度：相邻两个峰的保留时间之差与两峰宽度平均值之比。《中国药典》2015年版规定：

作定量分析时，为了获得较好

的精密度和准确度，应使R≥1.5。

Ｒ＜１.0两峰有部分重叠。Ｒ＝１.0两组分能分开，满足分析要求。Ｒ≥１.5两个组分能完全分开。Ｒ＜１.0Ｒ＝１.0Ｒ≥１.5问题1.两组分分离的前提条件是什么？2.两相邻色谱峰完全分离的判断依据是什么？

6.1-2层析分离技术分类1按色谱流动相分类2按色谱分离规模分类3按色谱分离原理分类4按色谱展开操作方法分类5按色谱固定相承载形式分类制备规模(100mg～20g)1.按层析分离规模分类层析分离的规模色谱分析规模(小于10mg)半制备规模(10～100mg)工业生产规模>20g。气相色谱气液色谱气固色谱液液色谱液固色谱色谱流动相固定相液体固体2.按流动相分类液相色谱

(1)气相色谱图1图2图3(2)液相色谱图4图5图6液相色谱组成示意图图8中压制备液相色谱仪图7自动液相层析装置Waters2695一体式高效液相色谱岛津LC-30A积木式高效液相色谱3.按分离原理分类分离原理吸附分配离子交换排阻亲和利用不同组分与固定相的高度专属性亲和力进行分离的方法亲和色谱法利用凝胶的结构特性根据试样分子的尺寸进行分离的方法凝胶色谱法利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法分配色谱法利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法吸附色谱法离子交换色谱法利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法4.按展开操作方法分类展开操作方法

将混合物样品加在色谱柱的顶端，然后自顶端加入顶替剂（流动相）顶替法（取代法）将混合物样品加在色谱柱管顶端，然后自顶端连续不断加入一种冲洗剂（即流动相）洗脱法（冲洗法）以试样本身作流动相，将样品通过色谱仪的流动相供给系统连续加入到色谱柱。迎头法（前沿法）ABCDABC

AB

A

试样（A+B+C+D）混合物，E顶替剂C+EEB+E

EA+EE图9洗脱法试样（A+B+C+D）混合物，E洗脱剂图11迎头法图10顶替法试样（A+B+C+D）混合物ED+EEDCBA已知：试样各组分与固定相结合力大小为A<B<C<D图12色谱分离洗脱过程5.按固定相的承载形式分类纸色谱法色谱过程在固定相构成的层析滤纸内进行的色谱法薄层色谱法色谱过程在固定相构成的薄板层内进行的色谱法柱色谱法将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程在色谱柱内进行的色谱法气相色谱液相色谱分配色谱法吸附色谱法程序升温高效

固定相承载形式展开操作方法分离原理色谱流动相色谱分离规模总结6.2纸层析与薄层层析1纸层析和薄层层析分离过程2操作步骤3薄层层析操作录像4薄层层析定性与定量5薄层层析特点及应用6薄层层析技术发展7思考题1.纸层析和薄层层析分离过程纸层析薄层层析纸巾通过毛细作用吸收液体纸层析操作过程

比移值2.操作步骤薄层制备点样展开显色检测（1）薄层的制备薄层的制备纸层析的选择与裁剪薄层制备薄板的制备湿法制板加入粘合剂干法制板不加粘合剂和水各种型号硅胶板区别硅胶G硅胶CMC硅胶GF254硅胶H硅胶HF254煅石膏CMC-Na没有粘合剂添加煅石膏和荧光剂不添加有粘合剂，添加荧光剂(2)点样2mm(3)展开纸层析展开薄层层析展开上行展开下行展开二维展开展开方式常见溶剂的极性大小：石油醚（Ⅰ类，30~60℃）＜正己烷＜石油醚（Ⅱ类，60~90℃）＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜二氯乙烷＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜正丁醇＜四氢呋喃＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜二甲基甲酰胺（DMF）＜乙腈＜甲醇＜水<吡啶<乙酸展开剂溶剂体系的配制弱极性溶剂体系中等极性的溶剂体系强极性溶剂正己烷和水氯仿和水正丁醇和水乙酸乙酯、乙醇、甲醇乙酸乙酯、乙醇、甲醇黄酮、极性弱的萜类和生物碱等的分离蒽醌、香豆素、极性较大的木脂素和萜类的分离极性很大的生物碱类化合物的分离待测组分的Rf在0.2～0.8之间可使各成分间有较好的分离对所需成分有良好的溶解性混合溶剂最好新鲜配制展开后组分斑点圆且集中沸点适中，黏度较小不与待测组分发生化学反应展开剂选择仅仅考虑溶剂的极性大小排列顺序石油醚（Ⅰ类，30~60℃）＜正己烷＜石油醚（Ⅱ类，60~90℃）＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜乙醚＜二氯乙烷＜二氯甲烷＜氯仿＜乙酸乙酯＜四氢呋喃＜正丁醇＜丙酮＜吡啶＜正丙醇＜异丙醇＜乙酸＜乙醇＜乙腈＜二甲基甲酰胺（DMF）＜甲醇＜水

(4)显色、检测3.薄层层析技术发展薄层色谱扫描仪普通硅胶薄层色谱板高效硅胶薄层色谱板粒径：10-15μm涂层厚度：250μm分离时间：30-200min粒径：5-10μm涂层厚度：200μm分离时间：3-20min6.3吸附分离柱层析介绍固定相承载方式纸层析薄层层析柱层析吸附柱层析离子交换柱层析分配柱层析凝胶过滤柱层析亲和柱层析柱层析是按固定相的承载方式分类简易层析装置柱层析操作装置手动层析装置自动层析系统装置层析操作装置图01吸附柱层析原理式中Cs-------组分在固定相中的浓度；

Cm-----组分在流动相中的浓度柱层析三要素在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相固定相混合物中各组分待分离物质色谱过程中携带待测组分向前移动的物质，与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相流动相吸附解吸加样洗脱吸附柱层析原理形象化解释龙舟行进快慢物质分离先后龙舟水阻力人推力待分离组分固定相吸附力流动相解吸力龙舟比赛层析分离02吸附介质吸附介质硅胶氧化铝聚酰胺羟基磷灰石由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂由Al(OH)３脱水制得的颗粒吸附剂由己内酰胺聚合而成的白色多孔性非晶形粉末由Ca3(PO4)2和CaCO3按一定比例同时注入高压水蒸气在高温下反应制备而成[Ca5(PO4)3OH]2吸附介质具备条件被吸附物质的理化性质吸附剂本身性质吸附介质选择原则吸附介质选择原则可逆吸附粒度均匀不易破碎溶解性能和化学性能稳定较大比表面积吸附介质具备条件“相似相溶”原理6.4

离子交换柱色谱离子交换柱色谱操作示意图21梯度混合器色谱柱（φ1.0×20cm）恒流泵核酸蛋白检测仪记录仪部分收集器DEAE-SepharoseFastFlow1、50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3缓冲液2、50ml20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液胰岛素离子交换柱色谱装置01装柱均匀平整没有气泡垂直安装当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0的范围内，可选择DEAE纤维素当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5的范围内，可选择CM纤维素蛋白质骨架选择12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换树脂吸附阳离子交换剂pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）稳定范围平衡缓冲液的用量----至少2BV平衡缓冲液的流速----略高平衡终点以流出液的pH值与缓冲液一致为准02色谱柱平衡pH<pI正电荷pH=pI净电荷为零pH>pI负电荷阳离子交换树脂：选择小于pI值的pH缓冲液平衡阴离子交换树脂：选择大于pI值的pH缓冲液平衡进样量--------介质交换容量的10-20%；样品浓度-------不宜太高交换容量：离子交换树脂中全部可交换的离子或功能基团的总数03样品进柱（上样）固定相----离子交换树脂平衡离子---可交换离子HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090溶液浓度（离子强度）或pH值04样品洗脱溶液浓度（离子强度）或pH值溶液浓度（离子强度）或pH值梯度洗脱21梯度混合器色谱柱（φ1.0×20cm）恒流泵检测器记录仪部分收集器pH值离等电点越远，所带净电荷越大蛋白质洗脱顺序的判断阳离子树脂分离该蛋白质，可采用pH值梯度不断增大的方法将各蛋白质洗脱下来阴离子树脂分离该蛋白质，可采用pH值梯度不断减小的方法将各蛋白质洗脱下来12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换树脂吸附阳离子交换剂pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）稳定范围1.有一蛋白质混合物，分子量相近，等电点分别为：A=9.7；B＝6.8；C＝4.5；

D＝8.5；E＝7.0。选择用CMC-纤维素离子交换柱分离纯化，用pH=3缓冲溶液中平衡柱子。如果用逐步增加洗脱液pH值的方法来进行梯度洗脱，则各蛋白质的洗脱顺序为（）

C.A>D>E>B>C

B.C>B>E>D>AA.A>B>C>D>E

D.A>D>B>E>CB05思考题6.5凝胶过滤柱层析介绍01凝胶层析概念02凝胶层析原理

Vt：柱床“总容积”；Vo：即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙

之间的水相容积；Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积；Vg：凝胶本身的容积；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg03凝胶体积

三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。04凝胶分离过程

（1）最先流出物质Ⅰ，Ⅰ分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其洗脱体积最小，等于外水体积V0。

（2）最后流出物质Ⅲ，它分子量最小，其分子可以自由进入凝胶颗粒，“全渗入”。洗脱体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi（3）物质Ⅱ分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。“部分排阻”或“部分渗入”。洗脱体积Ve=V0+KdVi五、

05凝胶分配系数当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。当0<Kd<1时，洗脱体积Ve=V0+KdVi，为部分渗入。06凝胶过滤柱层析过程1.脱盐07凝胶层析的应用2.去热源3.浓缩蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:LogM=k1-k2Ve（Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测Ve测4.测定分子量

葡聚糖凝胶及离子交换树脂柱层析纯化制备单组分胰岛素工艺流程：结晶胰岛素粗品—→水溶解—→Sephadex-G50纯化—→QAE-SephadexA-25纯化—→收集液浓缩—→透析脱盐—→冷冻干燥—→结晶—→单组分胰岛素5.纯化Sephadex-G50纯化胰岛素，除去胰岛素中前胰岛素和其它大分子抗原物质。胰岛素凝胶柱层析装置2.在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml,其外水体积和

总体积分别为60和200ml，求分配系数是多少？（凝胶体积忽略）08思考题

1.在凝胶过滤（分级范围是5000~400000）中，下列哪种蛋白质最先

被洗脱下来（）A．细胞色素C（13370）

B．肌球蛋白（400000）C．过氧化氢酶（247500）

D．血清清蛋白（68500）B

6.6亲和柱层析亲和层析：利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术。01亲和层析概述1.亲和层析概念加样用平衡液清洗用与配体亲和力更强的配基洗靶蛋白不能与配体结合的杂蛋白配体带有配体的凝胶球混合样品继续清洗2.生物大分子的识别功能酶：底物、抑制剂底物类似物抗体：抗原、病毒细胞激素：受体外源凝集素：糖蛋白表面受体蛋白核酸：互补碱基链段组蛋白蛋白质的结合部位及各种结合力应用分离纯化酶、抗原、抗体.分离纯化核酸.研究酶的结构与功能.+待纯化分子配体（基）理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质（载体）b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子sephadex、sepharose、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素基质（载体）02亲和层析原理（1）待分离物质与配体专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。（2）具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。（3）利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质03亲和层析特点04亲和介质的结构①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。③染料类主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等亲和层析介质的配体有很多，归纳起来主要有以下几类：1.配体纤维素(cellulose)葡聚糖凝胶(sephadex)聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel)多孔玻璃(Bio-Glass)琼脂糖凝胶(sepharose)聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶(Ultro-gel)2.载体（基质）常用的几种活化剂：溴化氰(CNBr)环氧氯丙烷1，4-丁二醚戊二醛、高碘酸盐等。3.载体的活化1.配体的选择2.载体（基质）的选择3.活化剂与偶联反应4.封闭5.亲和介质的技术指标05亲和介质的制备配体必备条件：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配体和目标分子的专一结合特性。②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。③配体与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。④在分离过程中配体与目标分子无空间阻碍。1.配体的选择酶----底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）抗体----抗原、病毒、细胞激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白常用的配体理想载体的特性：

①不溶于水，但具有高度亲水性。②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。③机械性能良好，在一定静水压下不变形。④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。⑤化学惰性，无或微弱的非特异性吸附作用。⑥有良好的物理和化学的稳定性。2、载体（基质）的选择纤维素葡聚糖凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

多孔玻璃琼脂糖凝胶交联琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶常用的载体①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化，引入不同的基团。②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到活化，有较高的活化效率。③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小，分离效率高。④非特异吸附极低，理化性质较稳定。3.凝胶类载体的特点（1）在较广的pH范围内正常工作（2）对去污剂、解离试剂保持稳定（3）用0.1mol／LNaOH或0.1mol／LHCl处理2～3h不引起凝胶颗粒的变化。（4）不被乙醇、丙酮等有机试剂所破坏。（5）能耐受6mol／L盐酸胍或7mol／L尿素处理（6）吸附剂能够再生并重复使用。凝胶类载体理化性质稳定性的要求（1）以生物大分子为配体的偶联反应（2）活化载体（基质）“接臂”

4.活化剂的选择与偶联反应（1）以生物大分子为配基的偶联反应①溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应②环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应（2）活化载体“接臂”②长臂(接臂)亲和介质①短臂(未接臂)亲和介质5.封闭加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露糖等。在弱碱性pH下过夜或在Tris—HCl缓冲液(pH8)中2h被水解。1、亲和层析操作流程亲和层析介质

预处理装柱、平衡与上样品洗去未吸附杂质

洗脱收集洗脱峰

06亲和层析