DB52T 1501.16-2020 农作物抗病性鉴定技术规范 第16部分：白菜抗芜菁花叶病毒病

农作物抗病性鉴定技术规范第16部分：白菜抗芜菁花叶病毒病I 1 1 1 2 3附录A(资料性附录)芜菁花叶病毒病原、症状及发生流行规律 4附录B(资料性附录)芜菁花叶病毒病原鉴定及保存方法 5 81农作物抗病性鉴定技术规范第16部分：白菜抗芜菁花叶病毒病24鉴定方法4.1接种体的准备将准确鉴定的芜菁花叶病毒(TuMV)储藏于-80℃冰箱备用(接种体的鉴定及保存方法见附录B)。4.2材料培养白菜种子直播于营养钵中，每钵直播1～2粒种，育苗土为专用育苗基质，设置3个重复，每个重复20株。人工气候室温度设置为白天25℃,夜间20℃;光照设置为每天12h。定期浇水和防治蚜虫。4.3接种4.3.1接种时期4.3.2接种方法采用人工摩擦接种法，参考NY/T2060.4并做修菌过的研钵中，加入5倍体积的磷酸缓冲液(0.05mol/L,PH=7.2)研磨匀浆，两层纱布过滤，立即用回摩擦2～4次，摩擦后用双蒸水立即冲洗叶面；接种后，黑暗24h再恢复光照。4.4.1调查时间待鉴定材料长至6叶期(一般接种后21d～30d)进行抗病性调查。4.4.2调查和计算方法共调查2次，接种后21d调查1次病毒病发病情况，28d调查第2次。用公式1计算病情指数，根据2次的病情指数结果进行校正，以消除待鉴定材料因生育期不同4.4.3病情分级3病情级别0植株正常生长，无任何症状。1接种叶和心叶初现症状。3感病叶片数占全株叶片数1/3以下。5感病叶片数占全株叶片数的1/3～1/2。7感病叶片数占全株叶片数1/2以上。9多数叶片重花叶，皱缩，畸形或有坏死斑，植株严重矮化，甚至死亡。5抗病性评价情指数达50时，视为该批次鉴定有效。抗病性评价分级见表2。芜菁花叶病毒抗病性级别0免疫(I)1抗病(R)35中感(MS)7感病(S)9高感(HS)4A.1病原5i)加入500μL漂洗液(检查加入无水乙醇),12,000rpm离心1min,弃掉废液；j)重复步骤9一次；1)取出吸附柱，放入一个RNasefree离心管中，加50μL～80μ总体积6GoScripTM5×ReactionGoScripTMReverseTranscriptase总体积a)TuMV-F:5’-TAAACGGAATGTGGGTGATGATGG-3';b)TuMV-R:5'-GTCCTCGGTCGTATGCCTTTC时间94℃(预变性)94℃(变性)55℃(退火)72℃(延伸)72℃(彻底延伸)7B.1.4.1统计好需检测样品的个数，选择合适的梳子和板子。B.1.4.2准备1个量程为250mL的三角瓶，称取0.25g琼脂糖(Agarose)至三角瓶B.1.4.3混匀后将三角瓶置于微波炉B.1.4.4将三角瓶内的液体全部倒入已插好梳子的板子中。B.1.4.5等30min后琼脂糖将会完全冷却并凝固，再小心拔下梳子，准备进行核酸电泳。B.1.4.6清洗干净核酸电泳槽之后，往电泳槽内倒入适量的1×rans2KTMPlusIIDNAMark种缓冲液，摩擦接种到枯斑三生烟(或心叶烟),7d～10d待烟叶上长出枯斑，挑取单个枯斑再次接种到烟叶，重复2次。纯化后TuMV接种到易感病白菜活体保存或将纯化后芜菁花叶病毒的样品储藏于将纯化的TuMV毒源接种到感病品种的白菜(如和美五号，经室内和田间鉴定为感病),显症后用