微生物学检验技术 课件汇 胡生梅 项目1-20 血液标本采集与处理-肠杆菌科鉴定

项目一血液标本采集与处理学习目标1．掌握血液标本的采集和与处理方法。2．熟悉标本的采集、送检、处理总的原则和注意事项。3．具有正确采集和处理临床常见标本采集与处理的能力。4．能对标本采集和处理不当做出分析。项目一血液标本采集与处理思维导图项目一血液标本采集与处理项目一血液标本采集与处理血液标本细菌学检查血液标本的细菌培养是诊断败血症的基本方法。如从患者血液中检出细菌，一般应视为病原菌。菌血症，一过性、间歇性、持续性项目一血液标本采集与处理血培养常见的病原菌主要有金黄色或表皮葡萄球菌、链球菌（A，B群、肺炎链球菌等）、产单核细胞李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒及副伤寒沙门菌，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属、厌氧菌和念珠菌等。项目一血液标本采集与处理血标本采集和运送：采血指征采血量:成人采血量是8～10ml,儿童1～5ml血液和肉汤之比为1∶5～1∶10血培养次数和采血时间具体操作标本运送项目一血液标本采集与处理项目一血液标本采集与处理菌血症时血液中的细菌并不多，通常仅10～20CFU/ml,故采血量大阳性率高。采血培养应该尽量在使用抗菌药之前进行,在24h内采集2～3次做血培养(一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单份血培养)。对间歇性寒战或发热，应在寒战或体温高峰到来之前0.5

1h采集血液，或于寒战或发烧后1h进行。标本运送:采血后应该立即送检,如不能立即送检,需室温保存或置35℃～37℃孵箱中,切勿冷藏。项目一血液标本采集与处理项目二脓液标本采集与处理学习目标1．掌握脓液标本的采集和与处理方法。2．熟悉标本的采集、送检、处理总的原则和注意事项。3．具有正确采集和处理临床常见标本采集与处理的能力。4．能对标本采集和处理不当做出分析。项目二脓液标本采集与处理思维导图项目二脓液标本采集与处理项目二脓液标本采集与处理脓液标本中常见病原菌

种类革兰阳性革兰阴性球菌金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、消化链球菌脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布兰汉菌杆菌结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、炭疽芽胞杆菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、拟杆菌、梭杆菌、肺炎克雷白杆菌、变形杆菌其他衣氏放线菌、诺卡菌项目二脓液标本采集与处理首先用无菌生理盐水清洗病灶杂菌，用酒精消毒表面，无菌抽取贴近伤口创面创伤分泌物和脓液作标本皮肤或下表皮的散播性感染，应取病灶边缘而非中央处检测厌氧菌要注意厌氧运送环境尽量避免接触空气，可床边接种或用厌氧运送培养基运送项目二脓液标本采集与处理项目二脓液标本采集与处理项目二脓液标本采集与处理项目二脓液标本采集与处理项目二脓液标本采集与处理项目三痰液标本采集与处理学习目标1．掌握痰液标本的采集和与处理方法。2．熟悉标本的采集、送检、处理总的原则和注意事项。3．具有正确采集和处理临床常见标本采集与处理的能力。4．能对标本采集和处理不当做出分析。项目三痰液标本采集与处理思维导图项目三痰液标本采集与处理项目三痰液标本采集与处理呼吸系统感染的细菌学检查上呼吸道：从鼻部到喉部，包括口咽和鼻咽，以及相连的腔、窦和中耳。咽炎、鼻咽炎、中耳炎、窦炎、会厌炎正常菌群：草绿色链球菌和肺炎链球菌非致病性奈瑟氏菌种、卡他布兰汉氏菌、类白喉杆菌嗜血杆菌酵母菌各种严格的厌氧性阳性球菌和革兰氏阴性杆菌项目三痰液标本采集与处理下呼吸道：包括气管、支气管和肺气管炎、支气管炎、肺脓肿、肺炎项目三痰液标本采集与处理正常人下呼吸道基本无菌，当机体全身或局部抵抗力减低时，上呼吸道的正常菌群可侵入下呼吸道，也可因直接吸入病原微生物或通过淋巴-血循环导致感染。下呼吸道标本主要为痰液和支气管分泌物，排出的痰液经过咽喉及口腔后，常混有上呼吸道的常居菌。上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。

项目三痰液标本采集与处理呼吸道标本中常见分离菌革兰阳性菌革兰阴性菌草绿色链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、其他葡萄球菌真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌放线菌、奴卡菌、结核分枝杆菌白喉棒状杆菌、假丝酵母菌脑膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌沙雷菌、变形杆菌大肠埃希菌及其他肠杆菌科细菌百日咳鲍特菌、不动杆菌铜绿假单胞菌及其他假单胞菌属细菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、副流杆嗜血杆菌项目三痰液标本采集与处理上呼吸道感染细菌性咽炎和扁桃体炎——化脓性链球菌猩红热、皮肤红疹风湿热、急性肾小球肾炎百日咳——百日咳鲍特菌白喉——白喉棒状杆菌鼻咽拭子标本的检测有助于猩红热、风湿热、急性肾小球肾炎病人的临床诊断；还可检出化脓链球菌、奋森螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、麻风杆菌等以协助诊断；对白喉、百日咳或口腔念珠菌感染的诊断有意义，应结合临床。

项目三痰液标本采集与处理上呼吸道标本的采集和运送 病人朝亮光处坐立，用压舌板压下舌头，无菌棉拭子擦拭扁桃体、咽喉壁及感染区域。不要接触舌或颊表面，最好同一处用两个拭子擦拭。

项目三痰液标本采集与处理下呼吸道感染咳嗽咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常见的症状，咳嗽的性质与痰的性状如脓或铁锈样痰具有鉴别诊断意义。咯血喉以下的呼吸道出血为咯血，包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。呼吸困难呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高。胸部影像学检查提示有感染可能。项目三痰液标本采集与处理项目三痰液标本采集与处理下呼吸道标本的采集和运送

1.自然咳痰法：以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或用牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。尽可能在用抗菌药物之前采集标本。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应≥1ml。咳痰困难者可用雾化吸入加温至45°C的100g/LNaCl水溶液，使痰液易于排出。对难于自然咳痰患者可用无菌吸痰管抽取气管深部分泌物。标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存≤2h。项目三痰液标本采集与处理2.支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法，均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。项目三痰液标本采集与处理3.小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳痰时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。项目三痰液标本采集与处理项目三痰液标本采集与处理下呼吸道细菌学检验标本涂片

显微镜白下细胞和鳞状上皮细胞计数判断标准

分类细胞数／低倍镜结果判断白细胞鳞状上皮细胞A>25<10合格可用于细菌培养B>2510~25尚合格可用于细菌培养C<10>25不合格，重送标本项目三痰液标本采集与处理实验室检查：采集痰或鼻咽拭子要来自于呼吸道合格的标本，以提高检出率和阳性的正确率。鼻咽拭子的细菌学检查应紧密结合临床。项目三痰液标本采集与处理项目四尿液标本采集与处理学习目标1．掌握尿液标本的采集和与处理方法。2．熟悉标本的采集、送检、处理总的原则和注意事项。3．具有正确采集和处理临床常见标本采集与处理的能力。4．能对标本采集和处理不当做出分析。项目四尿液标本采集与处理思维导图项目四尿液标本采集与处理项目四尿液标本采集与处理泌尿生殖道感染的细菌学检查尿液标本：尿路感染是人类最常见的感染之一尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖而引起的尿路炎症。诊断尿路感染最常用的方法是进行尿液标本的细菌学检查。根据感染可分为上尿路感染（如肾孟肾炎）及下尿路感染，男性还可出现前列腺感染，不同部位同时感染也很常见。项目四尿液标本采集与处理中段尿培养加计数对于泌尿道感染的诊断有重要价值。细菌培养必须结合菌落计数辨别是否为病原菌。有致病菌或条件致病菌生长，菌落计数>105/ml（球菌>104/ml），提示感染（膀胱炎，肾盂肾炎、肾或膀胱结核等）。常见病原菌主要有大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌、变形杆菌和伤寒沙门菌等。项目四尿液标本采集与处理尿液标本采集和运送采集指征有典型的尿路感染症状肉眼脓尿或血尿尿常规检查表现为白细胞或亚硝酸盐阳性不明原因的发热，无其他局部症状留置导尿管的患者出现发热膀胱排空功能受损泌尿系统疾病手术前。

项目四尿液标本采集与处理采集方法：标本采集应力争在未使用抗生素之前．注意避免消毒剂污染标本，方法有：清洁中段尿：最好留取早晨清洁中段尿标本，嘱咐患者睡前少饮水，将前段尿排去，中段尿约10-20ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检，2h内接种。该方法简单、易行，是最常用的尿培养标本收集方法，但很容易受到会阴部细菌污染，应由医护人员采集或在医护人员指导下由患者正确留取。

项目四尿液标本采集与处理耻骨上膀胱穿刺：使用无菌注射器直接从耻骨上经皮肤消毒穿入膀胱吸取尿液，是评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法，但有一定的痛苦．患者难以接受。主要用于厌氧菌培养或留取标本困难的婴儿尿标本的采集。项目四尿液标本采集与处理直接导尿：按常规方法对会阴局部进行消毒后，用导尿管直接经尿道插人膀胱，获取膀胱尿液，可减少尿液标本污染，准确地反映膀胱感染情况。但有可能将下尿道细菌引入膀胱，导致继发感染，一般不提倡使用。项目四尿液标本采集与处理采集容器应由不与尿液成分发生反应的惰性材料制成洁净、无菌、加盖、封闭、防渗漏不含防腐剂和抑菌剂广口、具有较宽的底部、容积应＞50ml、盒盖易于开启项目四尿液标本采集与处理标本运送标本采集后应及时送检、及时接种室温下保存时间不得超过2h（夏季保存时间应适当缩短或冷藏保存）4℃冷藏保存时间不得超过8h应注意冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养

项目四尿液标本采集与处理项目五粪便标本采集与处理学习目标1．掌握粪便标本的采集和与处理方法。2．熟悉标本的采集、送检、处理总的原则和注意事项。3．具有正确采集和处理临床常见标本采集与处理的能力。4．能对标本采集和处理不当做出分析。项目五粪便标本采集与处理思维导图项目五粪便标本采集与处理项目五粪便标本采集与处理粪便标本中常见的病原体肠毒素为主的病原菌霍乱弧菌、志贺菌(福氏、宋内)、大肠埃希菌(ETEC、EHEC、EAggEC)、金黄色葡萄球菌、难梭菌、产气荚膜梭菌。项目五粪便标本采集与处理侵袭性为主的病原菌沙门菌、大肠埃希菌(EPEC、EIEC)、志贺菌(鲍氏、志贺)、弯曲菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、结核分枝杆菌、白假丝酵母菌。项目五粪便标本采集与处理临床意义感染性腹泻：最为常见，为胃肠炎的症状，由多种病原体感染所致。细菌性痢疾：是指由志贺菌属(福氏和宋内氏)引起的肠道传染病。常有里急后重和脓血样便，中毒性痢疾见于小儿。发病率呈下降趋势。粪培养对诊断有价值。项目五粪便标本采集与处理细菌性食物中毒：常见于沙门菌、副溶血弧菌、致病性大肠埃希菌、葡萄球菌、肉毒梭菌、腊样芽胞杆菌食物中毒。多发生在夏秋季，以暴发和集体发病为特征。致病性大肠埃希菌的肠道感染分为5类：即ETEC可致霍乱样肠毒素水泻，常见于儿童和旅行者腹泻EPEC可引起婴幼儿腹泻EIEC可引起志贺菌样粘液脓血便EHEC的0157：H7血清型可引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征EAggEC是可引起慢性腹泻的大肠埃希菌。

项目五粪便标本采集与处理粪便标本采集常用方法有：自然排便法、直肠拭子法

，临床多采用自然排便法采集粪便标本。标本立即送检，室温放置不能超过1小时。用物：无菌粪便盒或蜡纸盒、无菌竹签。粪便标本采集方法项目五粪便标本采集与处理自然排便法：自然排便法注意收集新鲜粪便，用无菌竹签取脓血、粘液、组织碎片部分的粪便1～3g，液体状粪便用无菌移液管取絮状物，量约1～3ml。标本采集后立即送检。运送途中严格按生物安全操作。项目五粪便标本采集与处理项目五粪便标本采集与处理粪便标本采集注意事项通常采用自然排出的粪便粪便标本务必新鲜，不可混入尿液，盛器应洁净干燥，如作粪便细菌学检查应采集于消毒的容器内项目五粪便标本采集与处理采集标本时应用干净竹签挑取有粘液或脓血部分的粪便，外观无异常的粪便应从粪便的表面不同部位、深处及粪端多处取材无粪便而又必须检查时，可经肛门指诊采集粪便，灌肠或服油类泻剂的粪便因过稀或混有油滴而不适合作检查标本项目五粪便标本采集与处理送检的粪便标本不能超过1小时核对患者信息是否齐全，标本量是否符合要求观察粪便的性状，如有无脓血、粘液、脱落坏死的肠粘膜组织、淘米水样、蛋花样便水样粪便可采用暗视野镜检，发现呈穿梭状极活泼运动的细菌，考虑为弧菌属感染项目五粪便标本采集与处理项目六细菌形态结构辨认学习目标1．掌握细菌的大小、形态与结构。2．熟悉细菌特殊结构及临床意义。3．了解细菌的概念与分类。4．学会正确使用光学显微镜油镜观察细菌。5．学会显微镜下辨认各种细菌形态和结构。项目六细菌形态结构辨认思维导图项目六细菌形态结构辨认一、微生物的概念与分类项目六细菌形态结构辨认一、微生物的概念与分类（一）微生物的概念存在于自然界的一大群体积微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。1.非细胞型微生物体积微小,能通过滤菌器，无典型细胞结构，无产生能量的酶系统，只能在敏感宿主活细胞内才能增殖，如病毒、类病毒和朊病毒。（二）微生物的分类一、微生物的概念与分类2.原核细胞型微生物仅有原始核,无核膜和核仁,核呈环状裸DNA团块结构。细胞器很不完善，只有核糖体。如细菌、放线菌、衣原体、支原体、螺旋体、立克次体。（二）微生物的分类一、微生物的概念与分类3.真核细胞型微生物细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，胞质内细胞器完整，如真菌。（二）微生物的分类一、微生物的概念与分类二、细菌的形态与结构项目六细菌形态结构辨认细菌属于原核细胞型微生物，是一类具有细胞壁的单细胞微生物，因此一个细菌就是一个细胞。二、细菌的形态与结构（一） 细菌的大小与形态（一） 细菌的大小与形态二、细菌的形态与结构测量细菌大小的单位是微米（μm）。多数球菌直径为1.0μm，中等大小杆菌宽为0.3～0.5μm、长为2.0～3.0μm。同一种细菌可因菌龄不同和环境等因素而有差异。1.细菌的大小2.细菌的形态

（一） 细菌的大小与形态二、细菌的形态与结构螺形菌杆菌球菌细菌的基本形态有三种：（1）球菌外观呈球形或近似球形，直径1μm左右，根据繁殖时细菌分裂平面不同和分裂后菌体之间相互粘附程度不同，可有多种排列方式。二、细菌的形态与结构（一） 细菌的大小与形态葡萄球菌双球菌

链球菌

二、细菌的形态与结构（一） 细菌的大小与形态八叠球菌四联球菌（2）杆菌形态多呈直杆状，也有的菌体稍弯；多数呈分散存在。不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。大的杆菌如炭疽芽胞杆菌长3-10μm，中等的如大肠埃希菌长2-3μm，小的如布鲁菌长仅0.6-1.5μm。二、细菌的形态与结构（一） 细菌的大小与形态

炭疽芽胞杆菌3-10μm大中

大肠埃希菌2-3μm小

布鲁菌0.6-1.5μm棒状杆菌链杆菌单杆菌分枝杆菌二、细菌的形态与结构（一） 细菌的大小与形态（3）螺形菌菌体弯曲，长度不等，可分为弧菌、螺菌、螺杆菌等几类。二、细菌的形态与结构（一） 细菌的大小与形态二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构1.细胞壁是细菌最外层坚韧而富有弹性的结构，与细胞膜紧密相连。革兰阳性菌（G+菌）和革兰阴性菌（G-菌）共有的细胞壁组分为肽聚糖，同时各自有其特殊组分。革兰阳性菌细胞壁革兰阴性菌细胞壁二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构（1）肽聚糖革兰阳性菌的肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥3部分构成三维网架结构。二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构（1）肽聚糖革兰阴性菌的肽聚糖仅由聚糖骨架和四肽侧链构成二维网状结构。二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构（2）磷壁酸为革兰阳性菌细胞壁所特有的成分，是由核糖醇或甘油经磷酸二酯键连接而成的多聚物，包括壁磷壁酸和膜磷壁酸。二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构二、细菌的形态与结构（3）外膜层为革兰阴性菌细胞壁的特殊成分，由脂质双层、脂蛋白和脂多糖3部分组成。（二） 细菌的基本结构脂多糖(LPS)LPS是Ｇ－菌的内毒素脂质A：毒性部分核心多糖：具有属的特异性特异多糖：菌体O抗原类似于细胞膜结构，双层内镶嵌着多种蛋白质称为外膜蛋白。位于肽聚糖和脂质双层之间，稳定外膜。二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构脂质双层脂蛋白维持细菌形态抵御低渗环境参与菌体内外的物质交换具有免疫原性，可以诱发机体的免疫应答细胞壁的某些成分与细菌致病性有关二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构细胞壁功能L型菌落形态大小不一，G－临床意义：慢性和反复感染常规细菌检查阴性二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构L型细菌葡萄球菌原型菌及L型形态组成：脂质双层，蛋白质（无胆固醇）功能：物质转运呼吸作用合成作用参与细菌分裂二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构2.细胞膜细胞膜内陷、折叠形成的囊状膜性结构，多见于Ｇ＋菌。功能：与分裂有关；类似真核细胞线粒体。中介体二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构白喉棒状杆菌中介体成分无色透明胶状物，由水、蛋白质、脂类、核酸及少量无机盐组成功能细菌新陈代谢的场所内含物质粒胞质颗粒核蛋白体二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构3.细胞质胞质颗粒：细菌储存营养物质。如：白喉杆菌的异染颗粒，成分为RNA，多偏磷酸盐质粒细菌染色体外的双链环状DNA带有遗传信息，能自我复制控制细菌某些特定的遗传性状核糖体蛋白质合成的场所某些抗生素作用部位二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构4.核质细菌的遗传物质称为核质或拟核集中于细胞质的某一区域，多在菌体中央无核膜、核仁二、细菌的形态与结构（二） 细菌的基本结构仅在某些种类的细菌才具有的结构二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构

荚膜荚膜二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构1.荚膜某些细菌在细胞壁外包绕的一层黏液性物质,为多糖或多肽,不易着色，经革兰染色后，只能见到菌体周围有未着色的透明圈。抗吞噬作用荚膜的功能黏附细胞作用

抗杀伤作用

抗干燥作用二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构具有免疫原性二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构2.鞭毛是某些细菌菌体表面细长呈波浪状弯曲的丝状物。所有的弧菌、螺菌、大多数杆菌和极个别球菌有鞭毛。鞭毛的主要成分是一种弹力纤维蛋白。二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构鞭毛的分类单毛菌双毛菌周毛菌丛毛菌电镜观察特殊染色后用普通光学显微镜观察压滴法或悬滴法观察细菌动力接种于半固体培养基观察其扩散生长现象二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构鞭毛的观察运动器官与致病性有关具有免疫原性二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构鞭毛的功能菌毛二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构3.菌毛是某些菌体表面生长的比鞭毛更细、短而直的丝状附属物。其化学成分是蛋白质，须用电子显微镜才能看见。遍布细胞表面每菌可达数百根短而直粘附结构每菌1～4根比普通菌毛长而粗传递质粒二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构性菌毛普通菌毛二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构4.芽胞是某些细菌（主要为革兰阳性杆菌）在不利环境条件下，细胞质浓缩后在菌体内形成的一个具有多层膜包裹的通透性很低的圆形或卵圆形小体。破伤风梭菌炭疽芽胞杆菌肉毒梭菌二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构芽胞的形状、大小及在菌体中的位置因菌种的不同而异，具有鉴别意义。判断灭菌效果潜在病源鉴别细菌二、细菌的形态与结构（三） 细菌的特殊结构芽胞的功能增强细菌抵抗力三、显微镜油镜的使用项目六细菌形态结构辨认（一） 光学显微镜的基本构造油镜观察低倍镜观察

调节光亮度

换片用前检查12435

用后复原6（二） 油镜的使用方法用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁调节光亮度低倍镜观察：粗调、细调高倍镜观察油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。（二） 油镜的使用方法显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心保护，不得随意拆散和碰撞。取送显微镜时，右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前，然后轻放于桌面上或柜箱内。镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。不用时，将镜头转离聚光器，油镜头朝前呈“八”字形，降下聚光器，对号放入镜箱。标本片按规定擦去镜油后放入标本盒，如该标本片不再使用，则投入消毒缸内。显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。（三） 油镜使用注意事项球形球菌螺形螺形菌杆菌形态细菌杆状（四） 显微镜下辨认细菌形态与结构（四） 显微镜下辨认细菌形态与结构（四） 显微镜下辨认细菌形态与结构（四） 显微镜下辨认细菌形态与结构微生物是存在于自然界的一大群体积微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。它可分为非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物三类，其中细菌是原核细胞性微生物的典型代表。细菌形体微小，以微米为单位，只能用显微镜才能观察到单个细菌，按其基本形态可分为球菌、杆菌和螺形菌三大类。细菌基本结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。细菌经革兰染色分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，二者细胞壁结构有显著的不同，导致这两类细菌在染色性、抗原性、致病性和对药物的敏感性等方面均有很大差异。细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞。荚膜和菌毛与细菌致病性有关，鞭毛是细菌的运动器官；芽胞是细菌的休眠形式，其抵抗力强，常作为灭菌的标准。普通光学显微镜最常用的一种显微镜，其油镜可放大1000倍。使用油镜时需在玻片标本上加香柏油以保证视野足够的亮度，提高分辨率。显微镜下可观察细菌基本形态和特殊结构，某些细菌还具有独特的形态学特征，具有鉴定意义。项目小结项目六细菌形态结构辨认项目六细菌形态结构辨认项目七不染色标本检查学习目标1．掌握细菌不染色标本检查压滴法和悬滴法的操作和结果观察。2．熟悉各种不染色标本检查细菌的操作、注意事项和结果观察。3．了解不染色标本检查的目的和意义。项目七不染色标本检查思维导图项目七不染色标本检查一、目的和意义项目七不染色标本检查不染色标本通常用于观察细菌形态、动力及运动状况。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。弧菌、螺旋体、弯曲杆菌等细菌形态和运动方式特征鲜明，具有诊断意义。常用的不染色检查方法有压滴法、悬滴法、毛细管法和暗视野显微镜检查法。一、目的和意义二、常用方法项目七不染色标本检查取生理盐水1滴于载玻片中央，挑取少许菌落或菌苔于盐水中磨匀（或直接挑一环增菌液），取洁净的盖玻片一张，轻轻覆盖其上，置显微镜下观察。二、常用方法（一）压滴法

取生理盐水1滴于盖玻片中央，挑取少许菌落或菌苔于盐水中磨匀（或直接挑1~2环增菌液），取洁净的抹有少许凡士林的凹玻片一张，翻转盖玻片轻轻覆盖其上，置显微镜下观察。二、常用方法（二）悬滴法用于检查厌氧菌动力，以毛细管（长60～70mm，管径0.5～1.0mm）接触培养物，让菌液吸入毛细管后，用火焰将毛细管两端熔封，将毛细管固定在载玻片上镜检。二、常用方法（三）毛细管法光学显微镜的一种，是在显微镜中装入特殊的暗视野聚光器。经暗视野聚光器后，照明光线不能直接进入物镜，而是形成倾斜的光线通过标本，标本的像是由标本散射和反射的光线形成的。数码暗视野显微镜二、常用方法（四）暗示野显微镜检查法暗视野显微镜形成的像，背景是黑暗的，像是亮的，由于反差的增大，提高了分辨率，所以适合于观察有鞭毛的细菌等。使用时应注意聚光器的数值孔径应大于物镜的数值孔径，以确保照明光线不进入物镜内。倒置暗视野显微镜二、常用方法（四）暗示野显微镜检查法三、影响因素项目七不染色标本检查三、影响因素操作因素制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。制片后尽快观察，避免水分蒸发而影响观察结果。玻片因素玻片应选择清洁无油渍的进行操作。使用暗视野显微镜时，载玻片的厚度以1.0～1.1mm为宜，太厚则影响调焦。光线因素不染色标本检验时，显微镜镜下光线不易太亮。可通过调节光圈大小和聚光器位置来控制光线的亮度，以达到最加效果。不染色标本通常用于观察细菌形态、动力及运动状况。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。弧菌、螺旋体、弯曲杆菌等细菌形态和运动方式特征鲜明，具有诊断意义。常用的不染色检查方法有压滴法、悬滴法、毛细管法和暗视野显微镜检查法。影响不染色标本检查的主要因素有：操作因素、玻片因素和光线因素。项目小结项目七不染色标本检查项目七不染色标本检查项目八染色标本检查学习目标1．掌握革兰染色和抗酸染色的原理、操作及结果判断。2．熟悉细菌染色标本检查的一般程序。3．了解特殊结构染色法和负染色法。4．能够正确使用光学显微镜油镜观察细菌。5．严格执行无菌操作，注意生物安全。项目八染色标本检查思维导图项目八染色标本检查一、染色标本检查的一般程序项目八染色标本检查只用一种染料对细菌进行染色的方法主要用于观察细菌的大小、形态和排列方式。常用的染料有亚甲蓝、结晶紫、石炭酸复红等碱性染料。染色方法为：细菌标本经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片干燥后即可在显微镜下进行观察。一、染色标本检查的一般程序（一）单染色法（二）复染色法用两种或两种以上的染料对细菌进行染色的方法。既可以观察细菌的大小、形态与排列方式，又能鉴别细菌的染色性。最常用的是革兰染色法。细菌染色的一般程序：

涂片--干燥--固定--初染—媒染--脱色--复染一、染色标本检查的一般程序二、常用染色方法项目八染色标本检查细菌革兰染色是由丹麦病理学家ChristainGram于1884年创立的一种染色技术，后经学者改进一直沿用至今，是细菌检验平台经常使用而不可或缺的检验技术之一。通过革兰染色可以将细菌分为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-），不仅为分类鉴定提供依据，而且能够指导临床用药。二、常用染色方法（一）革兰染色法渗透学说G+菌细胞壁结构致密，脂类含量少G-菌细胞壁较疏松，脂类物质多化学学说G+菌细胞内含大量核糖核酸镁盐G-菌含核糖核酸镁盐少等电点学说G+菌等电点低，pH2-3G-菌等电点高，pH4-5二、常用染色方法（一）革兰染色法1.革兰染色原理结晶紫染液1卢戈氏碘液295%酒精3稀释石炭酸复红4二、常用染色方法（一）革兰染色法2.革兰染液配置结晶紫10g95%酒精100mlA液草酸铵1g蒸馏水100mlB液结晶紫乙醇饱和溶液100ml1%草酸铵水溶液100mlA液20mlB液80ml结晶紫染液100ml二、常用染色方法（一）革兰染色法（1）结晶紫染液碘化钾2g蒸馏水100ml碘化钾水溶液100ml碘1g蒸馏水200ml卢戈氏碘液300ml二、常用染色方法（一）革兰染色法（2）卢戈碘液95%酒精

直接购买成品，不需要配制二、常用染色方法（一）革兰染色法（3）脱色液碱性复红乙醇饱和溶液100ml取饱和液10ml稀释石炭酸复红染液100ml碱性复红1g95%乙醇10ml5%石炭酸90ml蒸馏水90ml二、常用染色方法（一）革兰染色法（4）稀释石炭酸复红染液制片涂片干燥固定染色初染酶染脱色复染镜检油镜观察二、常用染色方法（一）革兰染色法3.革兰染色操作步骤初染（1min）媒染（1min）脱色（30-60s）复染（1min）吸去残水晾干水洗水洗水洗水洗二、常用染色方法（一）革兰染色法二、常用染色方法（一）革兰染色法4.革兰染色注意事项在进行革兰染色时特别要注意酒精脱色这一步，把握好脱色的时间。严格把握被检菌的培养时间，避免出现错误的染色结果。水洗时要用细流水冲洗。革兰染色时涂片不宜太厚也不宜太薄。控制好每一步染色的时间。革兰阳性球菌革兰阴性杆菌二、常用染色方法（一）革兰染色法5.革兰染色结果6.革兰染色实际意义鉴别细菌指导选择药物分析致病性二、常用染色方法（二）抗酸染色法分枝杆菌属的细菌，如结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，细胞壁中含有大量类脂（如分枝菌酸），使菌体不易着色，一般不用革兰氏染色。抗酸染色法是特异性地针对分枝杆菌属细菌的鉴别染色法。抗酸染色阳性的细菌称为抗酸杆菌。

分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色。细胞成分二、常用染色方法（二）抗酸染色法1.抗酸染色原理

分枝杆菌一般不易着色，要经过加热或者延长染色时间来促使其与石炭酸复红染液结合而着色。着色特点

分枝杆菌细胞结构中的分枝菌酸与染料结合牢固，一旦结合以后，就很难被酸性脱色剂脱色。难以脱色二、常用染色方法（二）抗酸染色法2.结果判断和报告结核杆菌染成红色，细长、直的或微弯曲杆菌，偶尔有杆菌着色不均，呈颗粒状者。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野，直到整个涂片找不到结核杆菌时，方可报告“未找到结核杆菌”。石炭酸复红染液13%盐酸酒精2碱性美蓝染液3二、常用染色方法（二）抗酸染色法3.萋－尼抗酸染色液的配制碱性复红乙醇饱和溶液100ml取饱和液10ml石炭酸复红染液100ml碱性复红1g95%乙醇10ml5%石炭酸90ml5%石炭酸90ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（1）石炭酸复红液浓盐酸3ml95%乙醇97ml3%盐酸酒精100ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（2）3%盐酸酒精液美蓝酒精饱和溶液100ml取饱和液30ml美蓝染液130ml美蓝2g95%酒精100ml0.01%KOH100ml二、常用染色方法（二）抗酸染色法（3）吕氏美蓝染色液厚涂片取标本在干净的载玻片上涂片，制成20mm×15mm大小的厚膜涂片。干燥自然干燥，让玻片上的水分挥发。固定玻片在酒精灯火焰外焰，以钟摆的速度通过火焰三次固定。二、常用染色方法（二）抗酸染色法（1）制片4.抗酸染色操作步骤初染石炭酸复红，冷染或热染脱色3%盐酸酒精复染碱性美蓝二、常用染色方法（二）抗酸染色法（2）染色二、常用染色方法（二）抗酸染色法（3）镜检二、常用染色方法（二）抗酸染色法每张载玻片只允许涂1份标本，不得涂2份或2份以上标本，以免染色过程中菌体脱落而导致阴阳结果混淆。抗酸染色的涂片要略厚，加温时随时补加染色液。抗酸染色时，脱色剂脱色时间宁长勿短。注意生物安全。5.抗酸染色注意事项临床意义鉴别细菌确定分枝杆菌感染程度判定分枝杆菌感染预后二、常用染色方法（二）抗酸染色法6.抗酸染色意义三、其他染色方法项目八染色标本检查三、其他染色方法（一）特殊染色法石炭酸复红法制片后滴加石炭酸复红染液，小火加热染料出现蒸汽约5分钟，冷后冲洗，用95%乙醇脱色2分钟，水洗，碱性亚甲蓝复染半分钟，水洗待干后镜检。芽胞呈红色，菌体呈蓝色。孔雀绿法制片后滴加5%孔雀绿，小火加热染料出现蒸汽15～20分钟，冷后冲洗，直至流出的水中无染色液为止，0.5%石炭酸复红复染5分钟，水洗待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。注意生物安全。1.芽胞染色三、其他染色方法（一）特殊染色法将新载玻片浸泡在95%的乙醇中，临用时取出用干净纱布擦干，滴1滴蒸馏水于玻片中央，用接种环挑取少许菌落点在蒸馏水滴顶部，置35℃孵箱自然干燥，滴加鞭毛染液染色1～2分钟，轻轻水洗（切勿用力太猛），自然干燥后镜检。鞭毛和菌体呈红紫色。2.鞭毛染色三、其他染色方法（一）特殊染色法制片后滴加结晶紫染液，在酒精灯上稍微加热至出现蒸汽为止，用200g/L的硫酸铜溶液冲洗染液（切勿用水洗），吸水纸吸干后镜检。菌体及背景呈紫色，菌体周围有一圈未着色的透明带。3.荚膜染色三、其他染色方法（一）特殊染色法4.异染颗粒染色制片后滴加A液（甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液）3～5分钟后水洗，滴加B液（碘化钾溶液）1分钟后水洗吸干镜检。菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。三、其他染色方法（二）负染色法背景着色而菌体本身不着色的染色方法。实际工作中常用墨汁复染色法来观察真菌及细菌荚膜。如新生隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。三、其他染色方法（三）荧光染色法荧光染色是用能够发荧光的物质对标本进行染色，在荧光显微镜下发出荧光。目前主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等病原菌的检测。如痰标本经金胺O染色后，在荧光显微镜下观察到金黄色荧光菌体。在普通光学显微镜下，可清楚地观察染色标本中细菌的形态和特殊结构，并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。用于细菌的染料主要有碱性和酸性两大类，细菌易与带正电荷的碱性染料结合，常用的碱性染料主要有碱性复红、结晶紫、美蓝等。细菌染色是常用的细菌形态检查法，分为单染色法和复染色法两大类。常用的复染色方法主要有革兰染色法和抗酸染色法。细菌革兰染色可以将细菌分为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-），不仅为分类鉴定提供依据，而且能够指导临床用药。细菌抗酸染色是特异性地针对分枝杆菌属细菌的鉴别染色法，抗酸染色阳性的细菌称为抗酸杆菌。

此外，还有特殊染色法、负染色法、荧光染色法等。项目小结项目八染色标本检查项目八染色标本检查项目九常用培养基制备学习目标1.掌握细菌的生长繁殖特征、生长曲线的概念以及四个时期的特点。2.掌握条件致病菌与菌群失调的基本概念。3.熟悉消毒与灭菌的基本原理。4.了解常用培养基的基本配制方法。5.树立正确的无菌操作观念和无菌操作的能力。项目九常用培养基制备思维导图项目九常用培养基制备一、细菌的生理项目九常用培养基制备概述1.细菌具有与其它生物相似的细胞结构和化学组成。2.细菌以无性二分裂方式进行繁殖，人工培养的细菌会出现典型的生长曲线。3.不同种类的细菌具有不同的酶系统，代谢途径不同，一些特殊的代谢产物可用来鉴定细菌。4.正常菌群可对人体发挥营养、生物拮抗、免疫等作用。5.培养基按照用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。项目九常用培养基制备1.化学元素

化学元素是构成所有生物的物质基础。根据各类化学元素所占比例的大小，可将其分为：一、细菌的生理（一）细菌的化学组成主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁等微量元素：钠、锌、锰、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等2.化学成分及分各种化学元素主要以有机物、无机物和水的形式存在于细菌细胞内，构成细菌生命体的各种组分水：占细胞在总重量的75-90%；有机物：蛋白质、糖类、脂类等无机物：钾、钠、铁、镁、钙、氯等；核酸：DNA、RNA特殊组分：肽聚糖、胞壁酸、磷壁酸、脂多糖等一、细菌的生理（一）细菌的化学组成1.带电现象革兰阳性菌等电点pH为2～3，革兰阴性菌的等电点pH为4～5。细菌一般多处于弱碱性、中性或弱酸性条件，因此细菌表面一般带负电荷。由于革兰阳性菌细胞壁中含磷壁酸较多，因此带负电荷更多。细菌的带电现象与细菌的染色反应、凝集反应、抑菌和杀菌作用有密切关系。一、细菌的生理（二）细菌的物理性状2.光学性质：细菌无色半透明，光线照射细菌时，一部分被吸收，一部分被折射，故菌液呈混浊状。单位体积中的细菌数量与浊度成正比，可用比浊法或分光光度计估计细菌数。3.渗透压：细菌体内含有高浓度的营养物质和无机盐，处于高渗状态。在纯水中菌体因吸水而胀裂。在高渗透环境中，菌体水分逸出，胞浆不能生长繁殖。

4.半透性：细菌细胞壁、细胞膜均有半透性，水及小分子物质可通过，有利于吸收和排出。5.表面积：细菌体积微小，但单位体积的表面积远比其他生物细胞要大，有利于细菌与外界进行物质交换，故细菌代谢旺盛，生长繁殖迅速。一、细菌的生理（二）细菌的物理性状1.环境条件：（1）适宜的酸碱度：多数菌：一般为pH7.2～7.6嗜碱：霍乱弧菌pH8.4～9.2嗜酸：结核分枝杆菌pH6.5～6.8一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢1.环境条件：（2）合适的温度：嗜冷菌:-5－30℃最适温度：10～20℃嗜温菌:10－45℃最适温度：20～40℃嗜热菌:25－95℃最适温度：50～60℃一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢1.环境条件：（3）必要的气体环境：

专性需氧菌：如结核杆菌专性厌氧菌：如破伤风梭菌、脆弱类杆菌兼性厌氧菌：大多数病原菌微需氧菌：如空肠弯曲、幽门螺杆菌一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢2.细菌生长繁殖的规律：（1）细菌的繁殖方式：无性二分裂（2）细菌的生长曲线：将一定数量的细菌接种中在适当的培养基，研究细菌生长过程的规律，以培养时间为横坐标，培养物中活菌数的对数为纵坐标，得出一条生长曲线。一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢2.细菌生长繁殖的规律：（2）细菌的生长曲线：1）迟缓期（A-B）2）对数生长期(B-C)3）平稳期(C-D)4）衰亡期(D-E)一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢3.细菌的代谢：（1）分解代谢：

是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并伴随能量释放的过程。（2）合成代谢：是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，是耗能过程，能量来源于分解代谢过程中产生的能量。

将两者紧密结合在一起的称为中间代谢。一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢3.细菌的代谢：（3）能量代谢：

根据生物代谢过程中受氢体的不同，细菌的生物氧化可分为有氧呼吸、无氧呼吸及发酵。1）有氧呼吸：此过程需要氧气作为最终受氢体，把糖类等有机物彻底氧化分解，产生出二氧化碳和水，同时释放出大量的能量。2）无氧呼吸：此过程是以除氧以外的其它无机物作为受氢体，把糖类等有机物分解成为不彻底的氧化产物，同时释放出少量能量。3）发酵：将自身的某些代谢产物作为受氢体，同时将后者还原成发酵产物。一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢二、微生物的分布项目九常用培养基制备二、微生物的分布（一）陆生环境微生物的分布：土壤微生物的数量和分布主要受到营养物、含水量、含氧量、温度、pH等因素的影响，集中分布于距地表10~20cm的耕作层，其中大部分为非致病菌，也有一部分来自人和动物体内的病原菌。（二）水生环境微生物的分布：水中的细菌群有水中天然的微生物群，也有来自土壤、尘埃、垃圾、人和动物排泄物中的微生物。水的来源及状态决定了微生物分布的种类和数量。（三）空气中微生物的分布：空气中微生物绝大部分来源于人和动物呼吸道产生的飞沫、进入大气的土壤尘粒、污水产生的气溶胶等。二、微生物的分布1.正常菌群：正常人体的体表及与外界相通的腔道都有一定数量和种类的微生物寄生，这些微生物在正常情况下对机体无害，甚至有益，称之为正常微生物群或正常菌群。（四）人体中微生物的分布二、微生物的分布（四）人体中微生物的分布♦体表皮肤♦与外界相通的腔道分布于二、微生物的分布正常菌群的生理意义：（1）营养作用：合成维生素、蛋白质、氨基酸、叶酸等物质（2）生物拮抗：阻止病原菌定居、繁殖（3）免疫作用：促进免疫器官成熟（4）生长发育作用：有利于宿主的生长、发育和长寿。（5）抗癌作用：可使致癌物质转变为非致癌物质。（四）人体中微生物的分布1.正常菌群：二、微生物的分布2.条件致病菌与菌群失调症：（1）条件致病菌：指的是正常情况下不致病，但是在某些特定条件下可致病，这样的菌群称为条件致病菌或机会致病菌。可导致其致病的特定条件包括：①寄居部位改变。②机体抵抗力降低。③菌群失调。菌群失调（dysbacteriosis）是指机体某部位正常菌群中各菌种间的比例发生较大幅度变化，由生理性组合转变为病理性组合的状态。（四）人体中微生物的分布二、微生物的分布2.条件致病菌与菌群失调症：（2）菌群失调症：由于菌群失调而导致的宿主出现一系列临床症状，称为菌群失调症或菌群交替症。菌群失调的发生多见于使用抗生素、医疗措施使用不当和慢性消耗性疾病等。（四）人体中微生物的分布二、微生物的分布3.致病菌：细菌的致病性是对特定宿主而言，致病菌(Pathogenicbacteria)是指能使宿主致病的细菌，反之则为非致病菌，但是二者并无明显界限。有些细菌在一般情况下不致病，但是在特定情况下就致病，我们称其为条件致病菌或机会致病菌。（四）人体中微生物的分布三、消毒与灭菌项目九常用培养基制备三、消毒与灭菌1.消毒（disinfection）：利用某种物理或化学方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的方法。2.灭菌（sterilization）：是指利用某种方法杀死物体中所有微生物（病原微生物、非病原微生物和细菌芽胞）的一种措施。3.防腐（antisepsis）：指应用化学或者物理的方法抑制微生物生长的一种方法。4.抑制（inhibition）：在某种药物亚致死剂量作用下导致微生物生长停止，在去掉这种药物之后生长仍可以恢复的生物学现象。5.无菌操作：无菌指的是没有活着的微生物存在。无菌操作是指在操作的所有环节都没有微生物的污染的方法。（一）基本概念1.两者要求达到的处理水平不同：消毒只要求杀灭或/和清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病。灭菌不仅要求杀灭或/和清除致病微生物，还要求将所有微生物全部杀灭或/和清除掉，包括非致病微生物。2.两者选用的处理方法不同：灭菌与消毒相比，要求更高，处理更难。灭菌必须选用能杀灭抵抗力最强的微生物(细菌芽胞)的物理方法或化学灭菌剂，而消毒只需选用具有一定杀菌效力的物理方法、化学消毒剂或生物消毒剂。3.应用的场所与处理的物品也不同：灭菌主要用于处理医院中进入人体无菌组织器官的诊疗用品和需要灭菌的工业产品，消毒用于处理日常生活和工作场所的物品，也用于医院中一般场所与物品的处理。（二）消毒与灭菌的区别三、消毒与灭菌1.抑菌剂(bacteriostaticagent)：能抑制微生物生长的物质。抑菌剂不能杀死细菌，但可以通过抑制细菌的生长，阻止细菌滋生过多、危害健康。2.消毒剂（disinfectant）：

通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物--细菌、真菌和藻类的化学制剂。其作用机制通常是不可逆的与靶细胞进行紧密的结合，使其生长不可恢复。3.溶菌剂(bacteriolysis)：能通过使细胞裂解的方式杀死微生物，这类物质能通过抑制细胞壁合成或损伤细胞膜的方式使细菌溶解，将这类物质加入到生长的细胞悬液后会导致细胞数量减少、细胞悬液浊度降低、透明度增加。（三）控制微生物的化学方法三、消毒与灭菌4.抗代谢物（antimetabolite）：

微生物生长过程通常需要一些生长因子，在微生物生长液中加入生长因子的结构类似物可以竞争结合其靶位点，干扰微生物的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。（三）控制微生物的化学方法叶酸的结构三、消毒与灭菌1.高温灭菌法：

用超过微生物承受的最高温度来杀灭微生物的方法称为高温灭菌法。主要包括干热和湿热两种方法。（1）干热灭菌法：

①烧灼：属于高温短时杀菌，利用高温使微生物的蛋白质及酶发生凝固或变性而死亡。这是应用最广泛而有效的灭菌方法，主要用于手术器械和物品的灭菌。②干烤：用干热灭菌箱（多采用机械对流型烤箱）进行灭菌。灭菌条件为：160℃维持2小时；170℃维持1小时；l80℃维持30分钟；高温下可达灭菌要求。适用于易被湿热损坏和在干燥条件下使用更方便的物品（如金属、玻璃、陶瓷及凡士林纱布条等）灭菌。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌1.高温灭菌法（2）湿热灭菌法：是指以高温高压水蒸气为介质，用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为：高压蒸汽灭菌法、间歇蒸汽灭菌法、巴氏消毒法、煮沸灭菌法和流通蒸汽灭菌法。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌2.辐射灭菌法包括γ射线、X射线和加速电子等，对各种微生物均有致死作用，细菌繁殖体对射线比芽胞要敏感。其机制是直接或者通过产生游离基，破坏DNA分子的共价键。3.紫外灭菌法：

波长在200nm～300nm的紫外线具有杀菌作用，以250nm～260nm最强，与嘌呤和嘧啶的吸收光谱高峰一致。紫外线可使DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成二聚体，干扰DNA正常转录，导致微生物的变异或死亡。但是由于紫外线穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸汽等均能阻档紫外线，因此一般用于手术室、病房、实验室的空气消毒。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌4.干燥灭菌法干燥可以使细菌脱水、盐类物质浓缩、蛋白质变性，而产生抑菌和杀菌的作用。5.过滤除菌法：

过滤除菌法主要用于血清、抗生素、维生素等不耐热也不能用化学方法除菌的生物制品及空气的除菌，但是不能除去病毒、支原体、衣原体等微生物。6.超声波灭菌法：超声波灭菌法是利用超声波的高频振动，引起溶液内瞬时真空状态，导致细胞裂解而达到灭菌效果的方法。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌1.抗生素（antibiotic）：抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，能抑制其他微生物生长或者杀死其他微生物。2.噬菌体（phage）：

噬菌体是病毒的一种，具有病毒的所有特性（个体微小；不具有完整细胞结构；只含有一种核酸）。其特别之处是专以细菌为宿主。噬菌体是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。（五）控制微生物的生物学方法三、消毒与灭菌四、培养基的成分与作用项目九常用培养基制备水既是细菌细胞的主要组成成分，又是细菌生长繁殖所必不可少的物质。水在细菌细胞中的主要生理功能有：①作为良好的溶剂，使营养物质溶解，利于细菌吸收；代谢产物的排泌也必须以水为介质才能完成。②作为良好的导体对细菌细胞温度调节起到很重要的作用。③维持蛋白、核酸等生物大分子天然构象的稳定和活性。④作为新陈代谢的重要媒介参与细菌细胞内一系列化学反应。（一）水四、培养基的成分与作用1.碳源是在细菌生长过程中为细菌提供碳元素来源的物质。碳源既是细菌合成蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶类等菌体成分的原料，又作为重要的能源物质为细菌提供生命活动所需的能量。2.氮源是指为细菌提供氮元素来源的物质。氮源一般不提供能量，主要为细菌提供合成菌体成分的原料，但是某些厌氧菌会在厌氧条件下分解氨基酸提供能量。（二）营养成分四、培养基的成分与作用3.无机盐细菌需要多种无机盐以提供其生长繁殖所需的各种元素，如磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁，以及微量元素钴、锌、锰、铜等。无机盐除构成菌体成分以外，其作用还有：①参与能量的储存和转运；②作为酶的辅基和酶激活剂，维持酶活性；③调节菌体内外渗透压；④某些元素与细菌的致病作用有关。4.生长因子生长因子是指某些细菌生长繁殖所必需的、自身不能合成或者合成量很小且不能满足自身生长需要的、必须由生长环境提供的有机化合物，如维生素、嘌呤、嘧啶、氨基酸等。（二）营养成分四、培养基的成分与作用5.微量元素微生物的生长过程中还需要一些微量元素。微量元素通常指的是对微生物生长起重要作用，但是需求量极其微小，通常在10-8~10-6mol/L（这里指的是在培养基中的浓度）。根据不同种类的细菌对营养物质的要求不同，可将细菌分成两类：①非苛养菌②苛养菌（二）营养成分四、培养基的成分与作用凝固剂指的是能使液体发生凝固的物质，最常用的为琼脂，特殊情况下还可以使用明胶、硅胶、卵蛋白及血清。一般配制液体培养基时不需要添加凝固剂。（三）凝固剂四、培养基的成分与作用（四）指示剂（五）抑制剂为观察细菌是否充分利用培养基中的营养物质，通常会加入一些指示剂，如酚红、溴甲酚紫等酸碱指示剂，以及亚甲基蓝等氧化还原指示剂。为促进目的菌生长，需在培养基中加入某种化学物质，有选择的抑制某些非目的菌生长，如抗生素、亚硫酸钠等物质。五、培养基的种类和用途项目九常用培养基制备1.天然培养基：由天然物质制成，化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，常用的天然培养基包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、玉米粉、牛奶、血清等。2.合成培养基：合成培养基是由成分完全已知的各种化学物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基。3.半合成培养基：在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分（一）按照培养基的成分来分五、培养基的种类和用途1.液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，生长速度快，代谢旺盛，适于作生理等研究、增菌培养、纯培养后观察细菌的生长现象，也常用于发酵工业。2.固体培养基：是在培养基中加入凝固剂，如2%~3%琼脂、明胶、硅胶等，融化待冷却后即为固体。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数、药敏试验和菌种保存等方面。3.半固体培养基：是在液体培养基中加入少量凝固剂，通常是0.2%~0.5%琼脂，琼脂融化冷却后呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、菌种鉴定及噬菌体效价滴定等方面。（二）按照培养基的物理性状来分五、培养基的种类和用途（三）按照微生物的种类来分五、培养基的种类和用途细菌培养基放线菌培养基酵母菌培养基霉菌培养基1.基础培养基：

基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基。2.加富培养基：也称为营养培养基，是在基础培养基中加入血、血清、生长因子、动植物组织提取液制成的培养基。3.选择培养基：是在普通培养基中加入特殊营养物质或化学物质，以抑制非目的菌的生长，促进目的菌的生长。4.鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。（四）按照培养基用途来分五、培养基的种类和用途六、培养基的配制项目九常用培养基制备（一）培养基的配制过程六、培养基的配制1.称量2.溶化3.调pH4.过滤5.分装6.包装7.

灭菌8、质量测试9、保存（二）配制培养基的注意事项六、培养基的配制1.营养物质的选择2.营养物质浓度配比3.控制pH条件4.防止污染项目九

常用培养基制备项目小结细菌的生理活动主要包括营养物质的摄取与合成、进行新陈代谢及生长和繁殖。新陈代谢是整个生理活动的中心，研究细菌的代谢对于菌种鉴定、了解细菌致病性、抗菌药物的开发都具有十分重要的意义。细菌的新陈代谢包括分解代谢与合成代谢，是细菌细胞与环境之间不断进行物质交换，以及细菌自身物质和能量的自我更新过程。不同种类的细菌酶系统也不尽相同，催化的反应不同，生成的某些具有特征性的代谢产物可用来鉴别细菌。培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐以及生长因子和水等。培养基按其物理状态可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基三类。按其特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。培养基配制之后应妥善保存，放置时间不宜过久，

并且每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。项目九

常用培养基制备项目十细菌接种技术学习目标项目十细菌接种技术1、掌握分区划线细菌接种技术、连续划线接种技术的目的、方法。2、掌握斜面接种技术、穿刺接种技术的目的、方法。3、了解液体培养基接种技术、倾注平板法的目的、方法。思维导图项目十细菌接种技术一、细菌的接种工具项目十细菌接种技术一、细菌的接种工具（一）接种环与接种针接种环与接种针是微生物检验中用来取菌、接种和分离细菌的器具，接种环是用来划线、纯菌转种、分离培养和挑取菌落及菌液、制备细菌涂片等。接种针主要用于挑取单个菌落、穿刺接种及斜面接种细菌等。一、细菌的接种工具（二）红外线接种环灭菌器红外接种环灭菌器是采用红外线热能进行灭菌的微生物检验仪器。使用方便，操作简单，无明火，不怕风，使用安全。可广泛用于厌氧培养箱、生物安全柜及运动的车辆等环境中进行微生物实验。二、细菌接种方法项目十细菌接种技术（一）、分区划线接种技术概述

分区划线接种技术是指把混杂在一起的不同种类的细菌或同一细菌群体中的不同细胞用接种环在固体琼脂胚芽及表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离细菌的纯种。由于这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才可得到纯种。此种方法多用于含细菌量较多的临床标本，如脓汁、粪便等。（一）、分区划线接种技术

方法

右手持接种环，先将接种环灭菌，待冷却后从待分离标本中挑取少量标本，左手持琼脂平板，将接种环深入皿内，先在培养基一角涂成直径约1cm大小的薄膜，并以此为起点在琼脂表面接续不重叠划线作为第一区；然后烧灼接种环，转动平皿至合适操作的位置，将接种环通过第一区3~4次，连续划线，线与线之间不要重叠作为第二区，，依次画第3、4、5。平板上每一区的细菌数会逐渐减少，直至分离出单个菌落。这里需要注意的是除了最后一区，其余各区划线面积不得超过平板面积的1/4。（一）、分区划线接种技术

方法

各区之间交叉3~4次，各区间交角大约为120⁰，画完第一区，第二、三、四区接种环需要灭菌。经过18~24h培养，第四区出现了很多单菌落，即为细菌的“纯种”（一）、分区划线接种技术方法（二）、连续划线接种技术概述

连续划线也是细菌分离纯化的一种方法，将含有多种细菌的临床标本和固体培养物，经过连续划线接种到固体培养基表面，由于划线的分散作用，使原来混杂在一起的细菌细胞在培养基表面分开呈单个菌，经18~24h培养后就得到单个菌落。此法适用于含细菌量不多的标本或棉拭子、咽拭子。（二）、连续划线接种技术方法

将标本或棉拭子、咽拭子等直接涂布于培养基的1/5处，然后以此为起点开始用接种环或棉拭子、咽拭子在平板表面连续不重叠划线并逐渐下移，直至划满整个琼脂平板表面。（二）、连续划线接种技术方法（三）、斜面接种技术概述

斜面接种技术主要用于保存菌种或细菌纯种增菌，也可以用于某些生化反应鉴定试验，如枸橼酸盐、尿素和克氏双糖铁培养基的接种。但由于目的不同，接种的方法也略有差异。（三）、斜面接种技术方法

用于保存菌种或细菌纯培养的斜面接种法是将接种环（接种针）烧灼灭菌，挑取单个菌落从培养基底部向上划一条直线，再从底部开始向上连续不重叠划曲线接种，线条尽可能的密且均匀；或者直接自下而上划曲线接种。用于生化反应鉴定的高层斜面培养基接种方法是用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，一般挑取菌落的顶端，先用接种针插入斜面正中垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上划曲线接种。斜面接种法（三）、斜面接种技术方法高层斜面接种法（四）、穿刺接种技术概述穿刺接种技术是用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中。穿刺接种法多用于半固体培养基或克氏双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种。其中，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。（四）、穿刺接种技术方法

接种时用接种针挑取细菌菌落，由培养基中央垂直刺入，至距管底约0.4cm处，在沿穿刺线退出接种针；克氏双糖铁、明胶等有高层斜面之分的培养基，先穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。（五）、液体培养基接种技术概述液体培养基接种技术是由斜面菌种接种到液体培养基中的方法。此种方法多用于各种液体培养基，例如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。（五）、液体培养基接种技术方法用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种方法应尽量避免接种环与液体培养基接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。（六）、倾注平板技术概述倾注平板技术是使标本中的细菌细胞充分分散开，并均匀的分布于平板培养基内，经培养后单个细胞或聚在一起的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落。倾注平板技术多用于兼性厌氧菌或厌氧菌的稀释定量培养和饮水、饮料、牛乳、尿液等标本的活菌计数。项目十细菌接种技术项目十一细菌培养技术学习目标项目十一细菌培养技术1、掌握细菌有氧培养、二氧化碳培养的方法。2、了解细菌厌氧培养的方法。3、熟悉全自动血液培养系统的原理及检测方法。思维导图项目十一细菌培养技术一、细菌有氧培养项目十一细菌培养技术一、细菌有氧培养概述有氧培养法是至需养菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养。本法是临床细菌实验室最常用的培养方法。一、细菌有氧培养

方法将已接种好的平板、斜面、液体培养基等在空气中置于37℃孵育箱内孵育18~24h，无特殊要求的细菌均可以在此条件下生长。少数生长缓慢的细菌需要培养3~7d，甚至1个月才能生长。另外，有的细菌最适生长温度是28~30℃，如鼠疫耶尔森菌，甚至在4℃也能生长，如李斯特菌。为了孵育箱内保持一定的湿度，可在其内放置一杯水。对于培养时间较长的培养基，接种后应将试管口用棉塞或硅胶塞塞好，再用石蜡-凡士林封固，以防培养基干裂。一、细菌有氧培养方法二、细菌二氧化碳培养项目十一细菌培养技术二、细菌二氧化碳培养概述二氧化碳培养是将已经接种的培养基放置于5％~10％co2环境中进行培养的方法。很多细菌在其生理生化代谢过程中需要co2，分解糖类产生的co2已足够其所需，且空气中还有微量co2，不必额外补充。只有少数细菌，如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等的培养，特别是在其初次分离时需要在5％~10％co2环境中培养才能生长良好。二、细菌二氧化碳培养方法co2培养箱是一台特制的培养箱，既能调节co2的含量，又能调节所需温度co2从培养箱外的钢瓶通入培养箱内，培养箱能自动调节co2的含量、温度和湿度，培养物置于培养箱内培养一段时间以后直接观察其生长结果，此法适于大型实验室应用。二氧化碳箱培养二、细菌二氧化碳培养方法二氧化碳箱培养二、细菌二氧化碳培养方法烛缸培养取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，将接种好的培养基放入缸内，点燃蜡烛后放入缸内，要将蜡烛放置在稍高于培养物的位置，缸盖或缸口均匀涂抹凡士林，盖严缸盖。蜡烛燃烧消耗氧，因氧减少而使蜡烛自行熄灭，此时容器内因蜡烛燃烧产生的co2约为5％~10％，基本可满足细菌co2培养的要求。最后连同容器一起置于37℃孵育箱内孵育，时间一般在18~24h，少数菌种需培养3~7d，甚至更长。二、细菌二氧化碳培养方法烛缸培养二、细菌二氧化碳培养方