白菜根肿病流行监测技术规范

1白菜根肿病流行监测技术规范本标准适用于引起白菜根肿病的芸薹根肿菌的核酸、菌体及土壤带菌检测，用于根肿病的诊断监测与流行预警。本标准适用于十字花科作物白菜根肿病的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T3101有关量、单位和符号的一般原则GB/T1.1-2020第一部分：标准化文件的结构和起草规则DB53/T442-2012油菜根肿病抗性鉴定技术规程DB34/T2785-2016油菜抗根肿病人工接种鉴定技术规程3术语和定义下列术语和定义均适用于本标准。3.1根肿病根肿病是由芸薹根肿菌（PlasmodiophorabrassicaeWorn.）引起的一种世界性的土传病害，主要症状表现为植株主根或侧根上数目和大小不等的肿瘤，形如短棒状或球形，地上部萎蔫、矮化，植株生长不良，影响十字花科作物产量和品质。3.2芸薹根肿菌属于原生动物界（Protozoa根肿菌纲（Plasmodiophoromycetes根肿菌目（Plasmodiophorales根肿菌科（Plasmodiophoraceae根肿菌属（Plasmodiophora）的一种专性寄生菌。引起白菜根肿病的病原物。3.3流行植物病原物大量传播，在一定环境下诱发植物群体发病并且造成严重损失的过程和现象。3.4检测一种通过特定的方法和工具检测病原物的核酸来确定侵染的方法。3.5聚合酶链式反应（PCR）2一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。3.6定量PCR反应一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环的产物总量的方法。通过内参法或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。qPCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。3.7病原菌从植物发病部位通过人工培养、纯化，再接种和分离等方法获得的病原菌的分离培养物。3.8孢子悬浮液病菌孢子均匀分散于水中不下沉，与水混合形成孢子悬浮液。3.9接种浓度用于人工接种的单位体积内根肿菌休眠孢子的数量。3.10病情级别人为定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。3.11发病率发病植株或植物器官占调查的植株总数或器官总数百分率，用以表示发病的普遍程度。3.12病情指数通过对植株个体发病程度（病情级别）数值的计算所获得的群体发病程度的数值化描述形式。4样品采集土壤和植物样品。样品具有真实性和代表性。样品采集后置于-80ºC环境内冷冻保存。5主要仪器及用具生物显微镜、血球计数板、育苗盘、低温保存箱、电子天平（感量0.01g）、高速冷冻离心机、破壁机、移液器、离心管、高温灭菌锅。6主要试剂蔗糖、70%乙醇、0.05%苯胺蓝、ddH2O、2×ChamQSYBRqPCRMasterMix、10×PCRbuffer、10×6.1检测方法取混匀的孢子悬浮液900微升与100微升的苯胺蓝染色剂混匀，5分钟后用显微镜观察并判断根肿菌的有无。根肿菌休眠孢子成球形，大小约3-5微米，可以被苯胺蓝染色剂染成蓝色。用血球计数器定量评3估根肿菌孢子悬浮液浓度。根据最终获得的根肿菌孢子悬浮液液体积及浓度，计算根肿菌休眠孢子量（个孢子/克并在根肿病鉴定数据、图片采集报告单中记录。7孢子收集冷冻的根肿病根瘤在室温下解冻，使用无菌水反复清洗表面，使用70%酒精进行表面消毒3分钟，然后在室温下风干10分钟。称取根肿病根50g，与300mL无菌水按照1：6混合，用榨汁机打碎，得到病根匀浆液。将匀浆液经8层灭菌纱布过滤，分装至50mL离心管，获得孢子悬浊液。将孢子悬浊液，离心2000×g，10分钟，4ºC离心，弃去上清液。在沉淀中加入5mL的40%蔗糖溶液，悬浮震荡，再次离心2000×g，10分钟，4ºC。两个离心管中的上清液转移到另一个新的50mL离心管，加30mL无菌水，离心4000×g，10分钟，4ºC，弃去上清液。沉淀中加入5mL无菌水，悬浮震荡，离心4000×g，10分钟，4ºC，弃去上清液。将沉淀与1mL无菌水混匀，获得孢子悬浮液。-20ºC冰箱保存。8悬浮液浓度采用血球计数法。将提取的孢子悬浮液梯度稀释，吸取10µL的孢子悬浮液样品放置于血球计数器计数区域，轻覆盖玻片于血球计数板的计数室，显微镜下观察根肿菌孢子，每个样品重复3次，计算样品孢子浓度。9土壤接种将细沙和土壤重复灭菌，将根肿菌孢子悬液（1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107）均匀混入细沙，再将含有根肿菌孢子的细沙与无菌土以1:3比例混合，制成浓度为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107个孢子每克沙土混合物，无菌水作为对照。10病情调查10.1调查时间10.2调查方法调查3个重复，每个重复不小于20株。调查时将植株根部与土壤中分开，采用自来水冲洗干净后，调查发病率并计算病情指数。结果计入附录表A.1。10.3发病率和病情指数计算发病率和病情指数调查公式，以及不同病情级别症状描述。0级为根部无肿瘤；1级为仅侧根有小肿瘤；1级为侧根有大肿瘤，主根有小肿瘤；1级为主根有大肿瘤。发病率（%）=发病总株数/调查总株数×100%。病情指数=Σ（发病等级×各级植株数）/（调查总株数×最高级数值）。11定量检测411.1核酸提取利用土壤基因组DNA和植物基因组DNA提取试剂盒，提取样品总DNA，获得DNA浓度应在20ng/µL11.2实时荧光定量PCR反应设定程序建立反应体系，通过特异性引物，对根肿菌特异性片段扩增，经定量PCR仪检测，评估扩增效果。11.2.1反应引物命名为PbITS591（PbITS591F：5'-CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC-3'；PbITS591R：5'-ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC-3'）。11.2.2反应程序95℃3min；95℃20秒，40个循环，60℃30秒，72℃30秒。11.2.3反应体系终体积为10µL，包括5µL2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，PbITS591-F(2.5µM)1.5µL，PbITS591-R(2.5µM)1.5µL，DNA模板2µL。11.2.4定量分析11.2.4.1标准回归线性方程建立根据孢子DNA模板浓度的对数作为横坐标和相应的定量循环值为纵坐标绘制标准方程，通过不同孢子浓度的Ct值进行Boxplot分析，建立标准线性回归方程y=–3.19079x+38.37479（R2=0.9958说明根肿菌不同孢子浓度的DNA定量PCR扩增与Ct值呈线性正相关关系。11.2.4.2土壤中根肿菌的定量检测根据标准线性方程结果，利用定量PCR反应，检测制备的含有不同根肿菌孢子浓度的土壤样品Ct值，建立土壤中孢子密度与Ct值线性关系。结果表明，土壤中根肿菌孢子密度与Ct值也呈线性正相关关系，线性回归方程y=–3.19629x+41.32057（R2=0.9961）。此外，标准线性回归方程与土壤孢子线性回归方程比较发现，斜率基本相同，截距有所差异，说明定量PCR扩增效率不受土壤影响，土壤中根肿菌的定量PCR扩增效率较高。此外，将根据线性回归方程的检测结果与对应制备的土壤样品的根肿菌孢子密度比较，发现定量检测结果准确性较高，变量偏差在5%以内。12根肿病流行危害等级通过对土壤中根肿菌密度与根肿病的发病率和病情指数相关性PCA分析表明，将根肿病流行危害程度划分为三个水平：孢子密度在1×104个孢子/g土或以下时，为轻度；孢子的密度在1×105个孢子/g土时，为中度；孢子密度达到1×106个孢子/g土或更高时，为重度。13数据收集与结果判定收集整理白菜根肿病流行检测过程中的各类信息、图片和资料，建立专门档案，妥善保管。最终5结果记录表见表A.1。通过土壤样品的定量检测，评估土壤中根肿菌孢子密度，实现对根肿病流行危害等级评价。同时，注意鉴定结果的准确性、精确性和有效性，对检测存在的问题、需要注意的事项和改进的要求做出分析报告。6白菜根肿病流行检测结果记录表白菜根肿病流行检测结果记录表见