免疫细胞及其功能检验技术（免疫学检验课件）

免疫细胞的分离与纯化免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞等。通过分离、纯化免疫细胞及其亚群，并对其数量和功能测定，可以判断机体免疫功能状态，对指导临床实践和科学研究具有重要意义。前言免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离方法很多，主要根据细胞表面标志、理化性状和细胞功能等特征。应根据实验目的、所分离的目的细胞群种类、数量和纯度等要求选择分离方法。所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性兼顾细胞纯度和获得率。一、白细胞的分离（一）自然沉降法加抗凝血于试管中室温或37℃中静置（30-60min）分层结果示意图（二）高分子聚合物沉降法抗凝血与等量3%明胶或6%右旋糖酐溶液混匀室温或37℃中静置（30～60min）分层结果与自然沉降法类似优点：速度快、得率高不足：白细胞黏性增加二、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴细胞和单核细胞。PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。细胞种类密度红细胞1.093白细胞1.092淋巴细胞和单核细胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各类血细胞密度常用的分离液：Ficoll液和Percoll液尤以密度为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分离法注意：温度以20℃最适宜，超过25℃影响细胞得率（二）

Percoll分层液法连续密度梯度分离液（Percoll液+PBS，离心）加入PBMC悬液或抗凝全血1000×g离心20min结果示意图三、淋巴细胞的纯化及亚群的分离采用Ficoll和Percoll分离法获得的细胞悬液成分仍然较为复杂、均一性不佳。通常需要进一步分离纯化淋巴细胞及其亚群。分离原理主要基于细胞的表面标志和功能等性质。淋巴细胞及其亚类的分离纯化是免疫学检验与研究的重要基础技术。（一）淋巴细胞的纯化去除红细胞：低渗裂解法、氯化铵裂解法。去除血小板：多次洗涤离心法、胎牛血清梯度离心法。去除单核细胞：黏附法、羧基铁吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴细胞亚群的分离E花环沉降法该法简便易行，主要用于T细胞的分离PBMC悬液与SRBC混合Ficoll法密度梯度离心收集管底细胞并低渗裂解尼龙棉分离法该法简单快速，可分离T细胞和B细胞PBMC悬液加入尼龙棉柱37℃中静置1～2小时预热的含小牛血清培养液洗脱获得T细胞冷培养液边冲洗边挤压获得B细胞（二）淋巴细胞亚群的分离免疫磁珠分离法（二）淋巴细胞亚群的分离流式细胞术分离法该法快速、细胞纯度和获得率高，可分离各种淋巴细胞及其亚群。（二）淋巴细胞亚群的分离四、吞噬细胞的分离吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中性粒细胞。分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。（一）单核细胞的分离Percoll密度梯度分离法流式细胞术分离法（常用方法）免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法）黏附法黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除单核细胞。（二）巨噬细胞的分离斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）操作要点：少量液体石蜡注入动物腹腔内，3~4天后冲洗出腹腔渗出液（70%~80%为巨噬细胞）。（三）中性粒细胞的分离右旋糖酐沉降法：操作要点：抗凝静脉血与6%右旋糖酐溶液按比例混合，室温条件垂直静置一定时间后，红细胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白细胞沉降速度慢位于上层，获取上层细胞。吞噬细胞功能检测一、中性粒细胞功能检测趋化功能检测：体内法（也称皮肤窗口法）体外法（滤膜渗透法/

Boyden小室法、琼脂糖平板法）吞噬功能检测：（吞噬金黄色葡萄球菌或白色念珠菌）杀伤功能检测：

溶菌法、硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验体内实验法--皮肤窗口法在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3小时后开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。（一）中性粒细胞趋化功能检测体外法--Boyden小室法Boyden小室体外法--琼脂糖平板法原理及技术要点

在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向右孔的移动距离B，计算趋化指数。趋化指数越大运动能力越强将细胞悬液与金黄色葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合，温育后涂片、固定和染色。在油镜下观察中性粒细胞对细菌的吞噬情况，计数100个细胞中吞噬和未吞噬细菌的中性粒细胞数，并记录吞噬的细菌数。（二）中性粒细胞吞噬功能检测（三）中性粒细胞杀伤功能检测硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验

方法：1.抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），温育25min；2.推片染色、镜检（含甲臜颗粒的中性粒细胞）。正常值：NBT阳性细胞率应7%~15%二、巨噬细胞功能检测炭粒廓清试验：主要用于动物实验吞噬功能检测：（吞噬鸡红细胞或白假丝酵母等）促凝血活性测定：正常小鼠肝中库普弗细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。主要用于动物实验（一）炭粒廓清试验（二）巨噬细胞吞噬功能检测巨噬细胞鸡红细胞或白假丝酵母＋孵育涂片染色镜检计算吞噬率和吞噬指数小结Ficoll单次密度梯度离心法分离外周血单个核细胞；流式