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文档简介

12法RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethodI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件起草单位：天津市农业科学院畜牧兽医研究所、农业农村部环境保护科研监测1有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法本文件规定了有机肥中活性大肠杆菌PMA-GB/T6682分析实验室用水规格和GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染的致病菌。4缩略语PMA：叠氮溴化丙锭（propidiummonoazPCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreactqPCR：实时荧光定量PCR（quantitativeSYBRGreenI：核酸凝胶染料(SYROX:参比染料（ROXreference2可以进入死亡细菌受损细胞膜，并永久修饰其DNA，阻断DNA的PCR扩增。在强光照射下，游离在溶液中未与核酸交联的剩余PMA可与水分子反应，生成没有活性的羟胺。羟胺不会对后续从活细菌提取的DNA）：6.1.7SYBRPremixExTaq染料法实时荧光定6.1.8qPCR标准品：含有目的基因的克隆质表1大肠杆菌uidA基因qPCR扩增引物5’-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3’5’-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’超净工作台、冰箱（0℃~4℃)、分析天平（精度0.01g）、恒温震荡培养箱、LED光解仪（波长465nm～475nm、温度低于37℃)、低温离心机（最大离心力≥器、核酸自动提取仪、qPCR仪、超微量将采集的样品混匀，用四分法将样品缩分至53应将样品放入0℃~4℃冰箱保存，放置时间不应超过24h。9检测步骤9.1样品制备将样品进一步缩分后研磨至全部通过Ø1mm尼龙筛，混匀。无菌操作下称取样品10.0g，加入到带玻取1mL上清液至离心管中，加入0.2mLPMA工作液，PMA终浓度约为8可选用等效的商品化核酸提取试剂盒，或选用核酸自动提取仪及配套试剂，参考附9.5标准曲线ccopies=×NA…………（1）NA——阿伏伽德罗常数，取6.02×1023。45A.1试剂盒洗液去除杂质，最终由洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来。试剂盒内包含的试剂规格和数量见表A.11瓶1瓶2瓶2瓶1瓶A.2耗材A.3仪器及设备A.4操作步骤A.4.1试剂添加A.4.2加样取200μL样品上清液，加入到萃取样品盘的1#列/6A.4.3启动推入底部。关闭自动核酸萃取仪进样门，按下“开始”按钮。萃取反应将在1小时内7[10]於颖.PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中食源性[11]盖冬雪,任洪林,卢士英,等.乳品中大肠杆

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