生物学基本技能 课件 Ⅷ 生物玻片标本的制作

生物学基本技能基本技能

Ⅷ生物玻片标本的制作01.实验目的02.生物玻片标本的类别03.载玻片和盖玻片04.装片标本的制作目录05.涂片标本的制作06.压片标本的制作07.滴片标本的制作08.切片标本的制作09.实验操作实训1.了解生物玻片标本的类别。2.掌握徒手切片和石蜡切片技术。3.掌握涂片、装片标本制作技术。一、实验目的生物玻片标本是生物标本的一个类别，其他类别的生物标本多是观察动植物的整体或部分结构形态，是从宏观上观察研究生物，生物玻片标本则是观察研究生物的某些组织、细胞、细胞器、染色体等，一些个体非常小的生物，也有整体做成玻片标本的，如果蝇、一些微生物等。根据不同的制作方法，生物玻片标本分为装片标本、涂片标本、压片标本、滴片标本、切片标本五大类。二、生物玻片标本的类别装片标本装片标本是指从生物体上取下来的组织块或直接用个体微小的生物体制成的玻片标本。适于对个体较小的动物、动植物较小组织块的观察研究，如植物表皮细胞装片，人体口腔上皮细胞装片，昆虫的翅、足、口器装片，果蝇的成体、蛹、幼虫、卵装片，微小生物如衣藻、水绵、变形虫、线虫、水螅装片，细菌装片，红色面包霉装片等。涂片标本涂片标本是指从生物体上采集的液体（如血液、骨髓液）均匀地涂抹于载玻片上制成的玻片标本。适于对细胞计数、形态观察等方面的研究，如人类血液涂片、人类骨髓液涂片等；适于制作涂片标本的材料有单细胞生物、小型藻类、血液、骨髓液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。压片标本压片标本是指将生物材料置于载玻片和盖玻片之间，施加一定压力，将组织细胞压散或将细胞压破制成的玻片标本。适于制作压片标本的材料有经过软化处理的植物组织和细胞、植物的生殖细胞、动物的组织和细胞、昆虫的唾液腺细胞和性腺细胞等。二、生物玻片标本的类别滴片标本滴片标本是指把动植物的组织或血液进行处理，制成细胞悬液，滴在载玻片上制成的玻片标本。适于对细胞中染色体的观察研究。例如，洋葱的染色体玻片标本、人类外周血染色体玻片标本、小白鼠骨髓细胞染色体玻片标本等。切片标本切片标本是指徒手或用切片机直接从生物体上切取的动植物组织薄片制成的玻片标本。适于对某一组织的结构特征、细胞形态的观察，如植物叶脉切片、植物根尖切片、动物血管切片等。因要求不同，可用刀片进行徒手切片；也可将组织块包埋于石蜡中用切片机进行石蜡切片，切成5～10μm的薄片，供光学显微镜观察；还可将组织块包埋于环氧树脂或甲基丙烯酸中用冰冻切片机进行冰冻切片，切成厚度在20～50nm的超薄切片，专供在电子显微镜下观察。二、生物玻片标本的类别（一）载玻片载玻片是制作生物玻片标本最基本的玻璃器皿。载玻片是用来放置显微观察材料的一种玻璃片或石英片。载玻片一般长7～8cm、宽2.5～3cm，标准厚度为1.1±0.04mm，可用范围最大可达11.2mm，太厚会影响聚光器效能，太薄则容易碎裂。按其平面上是否有凹陷，分为平面载玻片和凹陷载玻片。根据载玻片四周的光滑度，分为毛边载玻片和磨砂边载玻片。按能否直接在载玻片上写字，分为普通载玻片和记号载玻片。按用途，分为显微载玻片和细胞培养载玻片。新购买的载玻片的清洗：一般是先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗几分钟，晾干后用细软的纱布或擦镜纸轻轻擦拭，最后放置在70%乙醇中备用。使用过的载玻片，可以再度使用，但要经过洗液浸泡，然后用自来水和蒸馏水冲洗，冲洗完擦净后备用。在清洗或在擦洗载玻片时应用拇指和食指轻轻拿住载玻片边沿，不要让手指接触载玻片表面，以免油脂或指纹印在载玻片上面，影响制片和观察。三、载玻片和盖玻片（二）盖玻片盖玻片是覆盖在载玻片上的观察材料之上的一种更小、更薄的玻璃片。盖玻片起到进一步把材料固定、压薄、使材料不能接触到显微镜的物镜的作用。盖玻片一般为正方形，个别也有长方形、圆形。盖玻片的厚度有1mm、2mm、3mm等规格，最厚可以达到8mm。正方形盖玻片的大小有8mm×8mm、10mm×10mm、12mm×12mm、14mm×14mm、18mm×18mm、20mm×20mm、22mm×22mm、24mm×24mm等不同规格；长方形盖玻片的大小有24mm×32mm、24mm×40mm、24mm×60mm等不同规格；圆形盖玻片的大小有30mm、24mm、22mm、20mm、18mm、16mm、14mm、12mm等不同规格。盖玻片的清洗方法与载玻片一样。擦拭盖玻片时也应用细软纱布或擦镜纸，用拇指和食指拿住纱布或擦镜纸，将擦镜纸或纱布折叠，把盖玻片夹在中间，轻轻擦拭。盖玻片也可以重复使用，但要认真清洗和擦拭。三、载玻片和盖玻片（一）植物装片标本的制作1）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。2）滴加。把载玻片放在试验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。3）撕取。用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取内表皮一小块（面积如玉米粒般大小），把其浸入载玻片上的水滴中，用镊子轻轻展平。4）加盖。用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓放下，盖在要观察的材料上。5）染色。滴一滴碘液在盖玻片的左侧，用吸水纸从盖玻片的右侧吸引，使染液浸润全部材料。6）观察。在显微镜下观察细胞的形状和细胞排列的情况。注意：①放置盖玻片时，如果速度过快或手颤抖，都会使玻片中形成水泡，影响观察，因此盖玻片放置的速度要尽量缓慢，手保持稳定，要多练习放置盖玻片的方法；②注意区分视野中的细胞和气泡。气泡在视野中是圆形或椭圆形，有黑而粗的边缘，用镊子或解剖针按压盖玻片，气泡会变形、移动，细胞不会变形，也不会移动，无黑而粗的边缘；③注意去除装片中的气泡。可用滴水引流法把气泡引出来，也可以用镊子轻轻挤压盖玻片把气泡赶出来。四、装片标本的制作（二）动物装片标本的制作1）固定。把果蝇成虫放入卡诺固定液中，进行杀生和固定。2）保存。把杀死且固定好的果蝇放入70%乙醇中进行短期保存或长期保存。3）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。4）放置。用毛笔选取一只结构完整的果蝇，慢慢放置到载玻片的中间位置。5）舒展。用解剖针轻轻拨动，使果蝇背部向上，前、中、后足和翅膀以及触角展开，呈现一种自然站在载玻片上的状态。6）滴胶。用特制的滴胶棒，往果蝇身体上滴加配置好的加拿大树胶2～3滴。7）加盖。加上一个直径较小的圆形盖玻片，让盖玻片自然下垂。注意要让加拿大树胶填满整块盖玻片与载玻片的空间。8）干燥。25℃或室温条件下，平放8～10天。9）观察。在低倍镜或高倍镜下观察果蝇的复眼结构、腹部横纹、生殖器等。雄果蝇还要观察前足上的性梳。四、装片标本的制作（三）微生物装片标本的制作1）培养。培养真菌：将一个馒头加适量的水，用塑料袋把馒头包好，将包好的馒头放置在温度较高的地方2～3天，即可得到生长良好的真菌。2）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。3）滴加。把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。4）挑取。用解剖针在馒头上挑一点真菌，放置在载玻片上的清水中，并用解剖针轻轻将真菌分散开。5）加盖。盖上盖玻片，用镊子夹住盖玻片，将盖玻片的一侧与载玻片上的水相切呈45°的夹角，并慢慢放下盖玻片使装片里面没有气泡。6）敲击。用镊子或用火柴棒轻轻在盖玻片上敲击，使真菌均匀分布。7）清理。清理装片上多余的水。将吸水纸覆在盖玻片上，让其自然吸干装片上的水。8）观察。在显微镜下观察真菌的形状和特征。四、装片标本的制作（一）植物涂片标本的制作1）培养。按常规方法培养洋葱，使其生根，当根尖生长至1cm时用0.2%秋水仙素溶液再培养3～4h。2）固定。用剪刀剪取根尖，放入卡诺固定液中3～5h，进行杀生和固定。3）保存。固定好的材料存放于70%乙醇中。4）处理。用2.5%的纤维素酶和果胶酶处理40～50min，直至材料像豆腐一样松软。5）涂布。切取2~3个根尖的分生区，用镊子将材料捣碎并反复在载玻片中央位置涂抹，然后去掉多余的残渣。6）干燥。在材料上滴加几滴固定液，并快速用火柴把有材料处点燃，至火焰自动熄灭即可。7）染色。用醋酸洋红或碱性品红染液染色5～10min。8）冲洗。自来水缓缓冲洗几遍，把多余的染液去除。9）观察。适当晾干后，进行观察，从低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察洋葱的染色体。五、涂片标本的制作（二）动物涂片标本的制作1）滴加。左手拇指和食指平持一张载玻片，将采到的血滴滴到载玻片一端。2）涂布。右手持一张载玻片作为推片，呈30°～45°角于血滴前方靠近血滴。右手移动盖玻片使其一端与血液接触。将盖玻片往前推动，速度不能太慢，保证血液被均匀地涂布开。3）风干。做好的血涂片，在室温下放置几分钟，使其慢慢风干。4）染色。在涂布有血细胞的载玻片上滴加瑞氏染液A，染色1min，再滴加瑞氏染液B（B液为A液的3倍），染色3～10min。滴加B液后，用嘴或洗耳球轻轻吹动染液，促使两种染液混合。5）水洗。用流动较慢的流水慢慢冲洗载玻片，冲洗掉多余染液和一些沉渣。6）干燥。室温下放置几分钟，自然干燥。7）观察。在显微镜下进行观察，从低倍镜开始观察，逐次转换为高倍镜甚至油镜观察。五、涂片标本的制作（三）细菌涂片标本的制作1）培养。将细菌放在合适的培养基和合适的温度条件下进行培养，使细菌大量繁殖。2）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。3）挑取。无菌操作条件下，用接种环取细菌培养液1～2环。4）涂布。均匀涂布在载玻片的中央，涂布的范围为1～1.5cm。5）干燥。室温下自然干燥，也可以将载玻片在火焰上加热烘干或用电吹风吹干。6）染色。根据观察的需要决定染色方法。7）冲洗。把载玻片上的染液冲洗掉，室温下适当晾一会儿。8）观察。从低倍镜到高倍镜观察细菌的形态特征。五、涂片标本的制作（一）植物压片标本的制作1）培养。按常规方法培养洋葱，使其生根，当根尖生长至1cm时用0.2%秋水仙素溶液再培养3～4h。2）固定。用剪刀剪取根尖，放入卡诺固定液中3～5h，进行杀生和固定。3）保存。固定好的材料存放于70%乙醇中。4）处理。用2.5%的纤维素酶和果胶酶进行处理40～50min，也可用1N盐酸处理5～10min，直至材料像豆腐一样松软。5）切取。切取根尖的分生区（小米粒般大小），放置在载玻片的中央。6）染色。在材料上滴加醋酸洋红染液或碱性品红染液1～2滴，室温下染色5～10min。7）加盖。把盖玻片缓缓盖在材料上方。8）敲击。把一小片吸水纸放置在盖玻片上方，左手固定住盖玻片，右手用火柴棒高频率轻轻敲击盖玻片，促使材料块的细胞均匀地在载玻片上摊开。9）压片。把载玻片固定在实验台边上，右手拇指按在盖玻片上，突然用力下压，促使细胞破碎，染色体散开。10）观察。从低倍镜到高倍镜进行观察，找到染色体时，转用油镜观察染色体的特征，统计染色体的数目。六、压片标本的制作（二）动物压片标本的制作1）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。2）滴加。在载玻片中央滴加一滴生理盐水。3）解剖。用毛笔挑取一只果蝇幼虫，把幼虫放置在载玻片中央，让幼虫头部向右，尾部向左。左手拿一解剖针轻轻按住幼虫虫体中后部，右手拿一解剖针扎住幼虫头部口器部位（一小黑点处），轻轻向右拉动，使幼虫头部与身体分开，唾液腺就在果蝇口器的两边。4）挑取。根据唾液腺的位置和形态结构特征，找到两个唾液腺，把其周围的其他组织去除，仅仅剩下两只唾液腺在载玻片上。用吸水纸吸取生理盐水。5）染色。在材料上滴加一滴醋酸洋红染液，室温下染色5～10min，室温太低时，可以把载玻片在酒精灯上稍微加热，增加染色效果。6）压片。缓慢在材料上加上盖玻片，在盖玻片上加一层吸水纸，左手在实验台边缘固定载玻片，右手拇指按住载玻片上方，突然用力下压，把唾液腺腺体细胞压破，使唾液腺染色体压散开。7）观察。从低倍镜到高倍镜观察唾液腺染色体的形态特征和结构特征。六、压片标本的制作（一）植物滴片标本的制作1）培养。按常规方法培养洋葱，使其生根，当根尖生长至1cm时用0.2%秋水仙素溶液再培养3～4h。2）固定。用剪刀剪取根尖，放入卡诺固定液中3～5h，进行杀生和固定。3）保存。固定好的材料存放于70%乙醇中。4）处理。切取5～6个根尖的分生区，放入装有2.5%纤维素酶和果胶酶的离心试管中酶解20～40min，直至材料像豆腐一样松软。5）离心。每分钟1000转离心5min。6）低渗。倒去酶解液，加入1mL低渗液，用滴管把材料吹散开，呈现一个个细胞，再加入低渗液4mL，低渗15～20min。七、滴片标本的制作（一）植物滴片标本的制作7）固定。倒去低渗液，加入5mL卡诺固定液，固定10min。8）离心。每分钟1000转离心5min。可以把7）、8）步重复1～2次。9）制悬液。倒去固定液，离心管中可剩余1mL固定液。用滴管在离心管中反复吹吸，制成细胞悬液。10）滴片。用滴管吸取细胞悬液，滴管高度离载玻片30cm，向准备好的载玻片中央位置滴2～3滴。适当晾干载玻片。11）染色。在载玻片中央位置滴加改良碱性品红染液4～5滴，室温下染色10～15min。12）观察。低倍镜下找到所要观察细胞的视野，高倍镜下找到染色体散开的图像，油镜下观察染色体的形态特征，统计染色体的数目。七、滴片标本的制作（二）动物滴片标本的制作1）预处理。在实验开始前3～4h，给小白鼠在腹部注射秋水仙素溶液，小白鼠每克体重注射量为2μg。2）杀生。用拉断脊髓的方法处死小白鼠。3）取股骨。解剖取下小白鼠的股骨，用小片白纱布包在股骨上，用手反复搓动，以除掉股骨上的肌肉。4）抽骨髓。把股骨两端剪开，用小注射器把股骨中的细胞冲到离心管中。5）低渗。加入1mL低渗液，用滴管把材料吹散开，呈现一个个细胞，再加入低渗液4mL，低渗15～20min。6）离心。每分钟1000转离心5min。 7）预固定。倒去低渗液，加入5mL卡诺固定液，固定10min。七、滴片标本的制作（二）动物滴片标本的制作8）固定。倒去低渗液，加入5mL卡诺固定液，再固定10min。9）离心。每分钟1000转离心5min。 10）制悬液。倒去固定液，离心管中可剩余1mL固定液。用滴管在离心管中反复吹吸，制成细胞悬液。11）滴片。用滴管吸取细胞悬液，滴管高度离载玻片30cm，向准备好的载玻片中央位置滴2～3滴。适当晾干载玻片。12）染色。在载玻片中央位置滴加改良碱性品红染液4～5滴，室温下染色10～15min。13）观察。低倍镜下找到所要观察细胞的视野，高倍镜下找到染色体散开的图像，油镜下观察染色体的形态特征，统计染色体的数目。七、滴片标本的制作（一）徒手切片1）适用范围徒手切片是用手直接握住小刀，把选取的材料切成适于用显微镜观察的薄片。这种切片方法比较简便，有一把锋利的刀片在短时间内就可以完成。新鲜材料不经固定液处理就能切成10μm厚度的切片，有利于观察组织和细胞的生活状态及原有结构。2）实验物品准备（1）培养皿：皿中盛放清水，以供放置切下来的切片。（2）切片刀：刀口非常锋利的单面刀片或剃刀。（3）夹持物：可选用软硬适当的物体，如向日葵茎的髓部、甘薯的块根、萝卜的圆锥根、马铃薯的块茎等。有些较小或柔软多汁的材料，可以直接用拇指和食指夹持。有些材料更细小，更柔软，则可把材料夹在夹持物中进行切片，这样在切片时材料就不致弯曲、压坏或者破裂，从而能切出理想的切片。（4）毛笔：用来拨动或捞取薄的切片。八、切片标本的制作（一）徒手切片3）操作步骤（1）取材：选取木本植物的嫩枝、草本植物的茎、质地较厚的叶片和较大的子房，材料大小一般以切面长宽各0.5cm左右，高3～7cm。薄软易弯的材料，需要先切成适当大小的块状，将块状材料重叠多层，或放在夹持物中夹好再切。（2）固定：木本植物的嫩枝、草本植物的茎、质地较厚的叶片和较大的子房，可以夹持在手指之间进行固定。固定时左手大拇指与食指和中指相对，捏住材料，食指要在材料的切面下2～3mm处，拇指稍低于食指上缘。薄软易弯材料可以用夹持物进行固定。（3）切片：先将刀片在培养皿中的清水中蘸一下，手指固定的材料置于胸前，再以右手执刀放在左手食指上方，刀口向内对着材料。切片时自左向右靠臂力均匀的拉刀，即可得到薄片材料。（4）染色：用毛笔捞取较理想的切片放置在载玻片中央，用吸水纸吸干材料周围以及材料中的多余水分。滴1～2滴染液，室温下染色3～5min。（5）盖片：用镊子将洗净的盖玻片轻轻放在材料的上方，让其自然下垂。（6）观察：用显微镜低倍镜进行观察，找到组织或细胞后，转用高倍镜进行观察。（7）制作半永久切片：如遇到非常理想的玻片标本，可以制成半永久切片标本，以供较长时间观察。八、切片标本的制作（一）徒手切片4）注意事项（1）刀片要锋利：要选用质量好、锋利异常的刀片。每次用后必须擦干净，注意保护刀锋，以免生锈。（2）动作要规范：用手指夹持材料时，要按照要求进行一定的训练，特别应注意要用臂力，不要用腕力。动作达到规范要求后再进行正式切割。否则，会使切下来的切片不完整或厚薄不匀，有时不注意还会切伤手指。（3）用力要均匀：切割时用力要均匀，速度要一致。八、切片标本的制作（二）动物组织石蜡切片1）适用范围石蜡切片是组织学常规制片技术中应用最为广泛的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用于研究、观察及判断细胞组织形态变化的主要方法，而且已相当广泛地用于其他学科领域的研究中。2）实验物品准备轮转式切片机、切片刀、恒温水箱式摊片仪、经过清洁处理的载玻片（防尘备用）、眼科弯镊、中号羊毫毛笔和粘片剂、解剖刀、镊子、剪刀、解剖针、包埋器、染色缸、烧杯等。八、切片标本的制作（二）动物组织石蜡切片3）操作步骤（1）取材：取材的第一步是处死动物。处死动物要求手法迅速快捷，避免动物因过度痛苦组织细胞产生变化。处死动物的主要方法有：麻醉法、击头法、颈椎脱臼法、破坏脑和脊髓、股动脉放血、空气栓塞法。取材的方法有：根据实验目的选择动物；根据器官组织的结构特点选择部位；根据器官组织的结构特点选择切面方向。取材的注意事项：力求组织材料新鲜，取材时必须注意环境温度的影响，取材应力求小而薄，取材时应保持组织的原有形态，取材时刀、剪应锋利。。八、切片标本的制作（二）动物组织石蜡切片3）操作步骤2）固定。组织细胞经某些特殊的化学试剂浸泡后保持生前结构和状态的过程叫固定。只有将组织充分固定后，才能防止组织细胞在水解酶和病原微生物的双重作用下发生破坏，并且使组织细胞的组成成分如蛋白质、糖原、脂肪和各种酶类等变成非活性物质而得以保存。因此，固定是组织制片工作中一个必不可少的步骤。固定方法：直接固定；蒸汽固定。（3）脱水：组织经固定和水洗后均含有大量的水分，水分不能与透明剂相溶，因此必须用某些化学试剂将组织块内的水分逐级逐步地置换出来，以利于透明剂渗入组织内。能置换组织内水分并能与透明剂融合的化学试剂称脱水剂。脱水必须从低浓度开始逐渐转入高浓度，最后转入透明剂中。脱水必须彻底，否则将会给后期的制片带来困难。经常使用的脱水剂是乙醇、丙酮、正丁醇，其中以乙醇最为常用。八、切片标本的制作（二）动物组织石蜡切片3）操作步骤（4）透明：透明是制作石蜡切片所必须的一个重要步骤，脱水后的组织块内部被脱水剂所占领。由于大多数脱水剂不能与石蜡混合，因此必须经过一种既能与脱水剂混合又能与石蜡混合的“媒剂”的作用，这种媒剂称为“石蜡诱导剂”。它能逐渐渗入组织块内，最终将脱水剂从组织块中完全排出以利于石蜡渗入。这种“石蜡诱导剂”又称为透明剂。透明剂渗入组织后，组织块有光线透过，呈透明状态。透明剂渗入组织的过程称为透明。透明的时间根据组织块的大小、性质和透明剂的特性而定。常用的透明剂有二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷和水杨酸甲酯等，其中以二甲苯最为常用。八、切片标本的制作（二）动物组织石蜡切片3）操作步骤（5）包埋：用石蜡做支撑剂将组织包埋成块使其硬化以利于切片的过程称作包埋。在石蜡包埋前还需一个浸蜡的过程。组织块经过透明后，用石蜡作为渗入剂渗入组织内部以置换组织内透明剂的过程称作浸蜡。组织块浸蜡的过程必须在恒温箱中进行，组织块透明后立即投入保存在恒温箱中已经熔化的液状石蜡中，经数次纯石蜡的浸泡将组织中的透明剂置换，待石蜡完全浸入组织内部时即可包埋。（6）切片：石蜡切片易于制作大量极薄的并能进行连续切片的观察标本，而且石蜡包埋块又可长期保存，因此是组织制片技术中应用最为广泛的制片方法。仪器及器材准备：轮转式切片机、切片刀、恒温水箱式摊片仪、经过清洁处理的载玻片、眼科弯镊、中号羊毫毛笔和粘片剂等。八、切片标本的制作（二）动物组织石蜡切片3）操作步骤（7）染色和封固：组织细胞要通过染色才能在显微镜下显示其细微的结构特征。组织的染色方法最早是受纺织物印染技术的影响并从中得到启发而发展的。苏木精-伊红染色法（HE染色方法）至今仍被广泛应用于生物形态的镜检研究中。各种特殊染色方法也在不断推陈出新，用更为先进、更为科学的新方法取代以前的旧方法。组织切片贴附于载玻片上经过染色等一系列制片程序后，滴加封固剂，用盖玻片覆盖其上，以利于镜下观察，并借以阻断组织切片与外界的接触，从而防止组织切片脱片、受潮、干裂或遭机械磨损等，以延长切片的使用时间，这一步骤称为封固。封固分为干封和湿封两种。封固时的注意事项：A.无论干封或湿封，在封固切片时都必须避免产生气泡。B.封固剂浓度应适中，过稀或过浓均影响封固。C.选择大小合适的盖玻片，以盖好组织后四周约有2mm的余隙为宜。D.封固剂应避光保存。八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片植物切制片技术是制作在显微镜下观察的植物体特定形态和结构的玻片标本的技术方法，是从事植物形态学、结构植物学、植物细胞学、植物生殖生物学、植物发育生物学等学科领域的研究所必须掌握的重要手段。植物切制片的方法：一类是装片法，包括整体装片(全封)法、压片法和离析法。另一类是切片法，包括徒手(手工)切片法、滑动机切片法、冰冻(薄)切片法、火棉胶切片法、石蜡切片法、半薄切片法和超薄切片法等。单细胞或丝状体、薄的叶状体类型可用整体装片法；某些易压碎延展为薄片状的植物组织，可采用压片法进行；对于复杂的多细胞、组织致密的植物体则宜用离析法、切片法制作切片。

八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片1）适用范围在探讨植物分类学、植物生理学、植物生态学、植物病理学、植物遗传育种学、作物栽培学、果蔬栽培学等学科中的某些问题时，亦常加以应用。2）实验物品准备（1）实验器具：冰冻切片机、滑动切片机、半薄切片机和显微镜等。剃刀、单(双)面刀片、染色皿(缸)、小杯、毛笔、滴瓶、载(盖)玻片、镊子、解剖针、酒精灯、抹布、标签和夹持物(萝卜脆嫩的茎段)、旋转切片机、恒温箱、离心机、天平、熔蜡箱、切片刀、自动磨刀机、电热展片台、双筒解剖镜、量筒、量杯、烧杯、塑料筒、熔蜡锅、蜡带盘、切片盒等。（2）实验试剂：95%乙醇及不同稀释度的无水乙醇、1%的番红(水或70%乙醇溶液)、0.3%～0.5%固绿、达氏苏木精和10%的水配甘油等。

八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片3）操作步骤（1）取材：取材时应注意以下四点。①要选取健全、新鲜的材料。②材料不宜过大，以长约5mm为宜。③材料切取后即投入固定液中，以免发生变形。④固定材料的瓶上必须贴上标签，写明取材日期等。（2）固定：制片的第一步就是将材料迅速地杀死及固定，以保持细胞原有的结构，并使组织硬化，便于切片与染色。材料的固定通常选用混合固定液，以平衡匹配，调节效果。八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片3）操作步骤（3）冲洗：将固定好的材料，用与固定液同浓度的乙醇(50%或70%)冲洗3次，每次约隔2h，以洗去组织、细胞中的固定液。冲洗好的材料如需过夜，应从低浓度的乙醇换至70%乙醇中，方可保存。（4）脱水：用脱水剂(以乙醇最为普通和常用)渗入植物细胞组织中，使得细胞组织中原来含有的水分脱除干净，以便后继药物能更替进入其内。通过脱水，使材料适当硬化，以利于切片。（5）透明：材料经过脱水后，必须先用透明剂取代植物组织细胞中的乙醇，以便石蜡渗入其中。透明剂常采用二甲苯和氯仿等。透明时，也是逐步增高透明剂的浓度，步骤为：2/3纯无水乙醇＋1/3氟仿(或二甲苯)→1/3无水乙醇＋2/3氯仿(或二甲苯)→氯仿(或二甲苯)两次，在每级透明剂中的时间一般为2h，二甲苯的穿透力较强，不宜在其中放置过久。（6）浸蜡：浸蜡过程是用石蜡进一步取代植物细胞组织内的氯仿（或二甲苯），使纯石蜡充分透入植物体的各个部分。待石蜡凝固后，再切片，材料不至于压碎破裂。八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片3）操作步骤（7）包埋：包埋就是用纯石蜡将整个材料埋藏凝固起来的过程。包埋时，先要用质地坚韧、光滑不易透水的厚纸张折成小盒，折叠的方法可如下图所示的顺序进行：先将1、2和3、4向内折叠，再向内折叠5、6和7、8，然后再折叠5、9，6、9和7、10，8、10，最后按上述折好后沿着折叠痕拉开折成小盒。八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片3）操作步骤（8）切片：切片通常用旋转式切片机进行。在切片开始前，必须了解旋转式切片机的基本结构和性能，做好切片的准备工作。旋转式切片机一般包括机座、飞轮、厚薄调节装置、进退装置、夹物装置、载物盘、夹刀装置和切片刀等主要部分。切片刀必须保持十分锋利，要细心使用。切片时的注意事项：切片刀的刀口必须锋利，刀口与蜡块的角度必须正确；蜡块中材料的位置必须正中，蜡块中不能有气泡；切片时不可对蜡带讲话或深呼吸，以免吹乱蜡带；蜡块的上下两边要修成两边平行，才能切出连续的蜡带。八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片3）操作步骤（9）贴片和干片：在干净的载玻片上，滴一滴粘片剂。常用的粘片剂是用等量的鸡蛋白和甘油均匀搅拌，并加入微量的麝香草酚（防腐剂）经过滤而成。再在粘片剂上方加一点蒸馏水。用快刀将蜡带分割成小段，并将小段蜡带移到载玻片上，使蜡带的光面朝下。因为光泽的面更为平整，烫片、干片后，粘贴得更牢。再将此载玻片移于36～40℃烫片箱上，待蜡带受热完全展平后，用吸水纸吸去多余水分，再放入36～40℃的温箱中继续烘烤1～2d。（10）脱蜡和染色：将已干的玻片标本，插入盛有二甲苯的染色缸中，先脱蜡10～15min，然后进行染色。高等植物的根、茎、叶组织切片，常用番红-固绿二重染色法。染色结果是木质化的细胞壁和细胞核被染成红色，薄而具有纤维素的细胞壁及细胞质被染成绿色。八、切片标本的制作（三）植物组织石蜡切片3）操作步骤（11）封片：封片时把玻片从二甲苯中取出，用干净的纱巾擦去切片材料四周多余的二甲苯，然后滴上一小滴中性树胶，盖上盖玻片，树胶用量要适当，要正好充满盖玻片下面。（12）贴标签、干固与保存：在玻片的左端贴上标签，注明材料名称和制片时间，然后平放于切片盘上，再把它放在50℃左右温箱中烤数天即可干固(树胶自然干固一般需要1个月以上)，最后将制成的玻片标本置于切片盒中避光保存。八、切片标本的制作（四）冰冻切片1）适用范围冰冻切片主要用于手术中新鲜组织做病理快速诊断，确定病变的性质、肿瘤有无转移、切除残端有无病变，为手术治疗提供可靠的依据。因此，高质量的冰冻切片和快速出片至关重要，要求病理技术员在冰冻切片过程中要熟练掌握冰冻切片的要点和各种组织成分。同时，掌握冰冻切片机的性能和冰冻切片的技巧。冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。2）冰冻切片的优缺点优点：①简便，不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节；②快速，用时短；③组织变化不大；④能很好保存脂肪、类脂等成分；⑤能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是那些对有机溶剂或较高温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。缺点：①不容易做连续切片；②切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果；③不容易制作较薄的切片；④组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。八、切片标本的制作（四）冰冻切片3）实验物品准备（1）器具：冰冻切片机、剪刀、镊子、锡箔纸、标签纸、刀片、多聚赖氨酸包被的载玻片、切片盒、切片架。（2）试剂：4%的多聚甲醛、组织包埋剂、30%的蔗糖。4）操作步骤（1）组织处理：组织依次用磷酸缓冲盐溶液（或生理盐水）、多聚甲醛灌注后放入固定液中固定，待组织沉入液体底部后（约48h），换新的固定液，待用。（2）开机：将冰冻切片机右侧电源开关向上抬起。（3）温度：对速冻台及冷冻箱温度进行选择，通常速冻台温度为35℃，冷冻箱温度为20℃。（4）切片厚度：欲切的厚度，需根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多、细胞稀的可稍微厚切，一般切片厚度在5～10μm。八、切片标本的制作（四）冰冻切片4）操作步骤（5）组织修块：组织块不要太厚，太厚不易冷冻完全。将修好的组织放入异戊烷中，液氮速冻10s（组织变惨白，组织块较大可以适当延长速冻时间）。将冻好的组织放在样品托上，利用水或者包埋剂包埋固定，放到速冻台上冷冻，在即将完全冷透前用压平装置压平。（6）样本与刀片：可通过快进快退键、慢进慢退键以及持刀器底座的角度位置等调节样本与刀片的距离，将样品移近刀口，调整要切的平面进行修片。修好后可放下防卷板进行切片。（7）关机：连续几日使用时，不用关闭总电源开关，只需锁定关闭载物台温度。长时间不用需关闭总电源开关。（8）切片保存：可以贴片后晾干，或者放于冻存液中，长期保存于70℃冰箱中，短期内使用可以将切片放于磷酸缓冲盐溶液中，4℃储存。八、切片标本的制作（四）冰冻切片5）注意事项（1）用毛笔清理刀上的残留物时，要顺势刷扫，防止笔毛被损坏。（2）防卷板上下移动时，防卷板要离开刀刃。同时还要注意防卷板清洁时以及其他可能的磕碰。在有磕碰划痕情况下，防卷板不能起到防卷作用。（3）总开关开关机时间需间隔5min以上。长期不用（总开关已关闭），再次使用时机器需要提前预冷。（4）每次使用后注意清扫箱体内残留物，载物台温度低或者操作时间长引起箱体内霜含量较多时，注意适当降温除霜。八、切片标本的制作（四）冰冻切片6）冰冻切片机的使用、维护与保养（1）冰冻切片机使用步骤①按电源开关I/O侧的I（开）侧，接通仪器电源。待仪器进行短暂时间的初始化（屏幕上将显示一个沙漏标志）后，检查上方