13 体外受精与核移植动物课件

第13章体外受精与核移植动物13体外受精与核移植动物本节主要内容13-1体外受精动物（试管动物、试管婴儿）13-2核移植动物（克隆动物）13体外受精与核移植动物13-1体外受精动物13体外受精与核移植动物一定义体外受精(Invitrofertilization，IVF)是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。体外受精动物也称试管动物（test-tubeanimal），是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。13体外受精与核移植动物例如：“世界山羊之王”波尔山羊体格高大，四肢粗壮，身体丰满。平均日增重350克，屠宰出肉率可达60%以上。具有适应性强、采食性广、繁殖性能好、肉用性十分显著等特点。

二优点（1）发挥优良母畜的繁殖潜力：一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，最后一个卵泡成熟并排卵。一只良种母畜一生大约只能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。试管动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力。（2）促进家畜改良的速度：繁殖能力的提高促进家畜改良速度，加速育种过程。（3）保存遗传资源：对优良或稀有哺乳动物建立“胚胎库”，进行受精卵或胚胎的长期保存。13体外受精与核移植动物三试管动物培育流程（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养（2）体外受精（3）重组胚激活与体外培养（4）胚胎移植(Embryotransfer，ET)：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术（5）体内发育、出生13体外受精与核移植动物1精子采集与体外获能采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。精子获能(Capacitation)是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。精子的顶体反应：遇到卵子时，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。13体外受精与核移植动物体内获能雄性精液中含有“去能因子”（多是：糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力：主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高，可以水解糖蛋白等“去能因子”。13体外受精与核移植动物体外获能精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。13体外受精与核移植动物2卵子的回收与成熟培养(1)超数排卵：雌性动物用孕酮、促卵泡激素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子，可直接与获能精子受精。(2)从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。成熟卵子的收集13体外受精与核移植动物卵母细胞体外成熟培养未成熟卵母细胞（初级卵母细胞、次级卵母细胞要经过成熟培养使卵细胞成熟。家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199培养基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。血清是大分子营养物质的主要来源，而且可提供细胞生长因子。作为能量来源的物质主要是葡萄糖，氨基酸也可作为能源起作用。卵母细胞的体外培养还需对温度、渗透压、pH、气相等进行控制。13体外受精与核移植动物卵母细胞体外培养：通常采用微滴培养法，微滴体积一般为50-200微升，每个微滴中一般放入10-40个卵母细胞。二氧化碳培养箱培养，条件为39℃、100%湿度、5%二氧化碳。成熟选择标志：极体排出、透明带软化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。13体外受精与核移植动物3试管动物的体外受精精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。13体外受精与核移植动物一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1-9×106/ml，每10微升精液中放人1-2枚卵子，小滴体积一般为50-200微升。受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。（1）共同培养法13体外受精与核移植动物（2）显微受精技术是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，由于一般都需要借助显微操作仪来完成，所以又称显微授精为辅助受精技术

(microinsemination)。13体外受精与核移植动物透明带下注射法术：用微注射器将3-5个精子直接注射入透明带下的卵间隙，从而使卵子受精。优点是对卵细胞的损伤小，已在临床医学上得到运用，但也存在多精受精问题。卵桨内精子注射法：用微注射器将单个精子直接注射入到卵细胞的细胞质内使卵子受精。这样可以避免多精受精问题。但是精子质量是重要问题。精、卵结合后，透明带的结构发生变化，阻止了其它精子穿越透明带，保证了正常的单精受精。13体外受精与核移植动物透明带修饰法：运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切除或撕开缺口，为精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程。这种方法适用于具有一定运动能力，但顶体反应不全，无法穿过透明带的精子。优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。13体外受精与核移植动物4胚胎培养受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期（细胞全能性最高）才能进行移植。目前人们还不能在体外模拟子宫内的环境供胚胎继续发育。通常情况，移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。培养液中成分除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。桑椹胚13体外受精与核移植动物发育阻滞问题

体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞(Developmentalblock)。发育阻滞是胚胎体外培养的一个主要障碍。造成胚胎发育阻滞的因素比较复杂，与胚胎的母源基因调控向自身基因调控的转换有关，也有培养环境的客观因素。总之，体外培养条件与体内发育条件的差异，造成了胚胎发育被阻断。克服方法：改进培养液成分和建立体细胞共同培养体系13体外受精与核移植动物5胚胎移植将胚胎移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位（输卵管或子宫角）。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。这就是通常所说的“借腹怀胎”。13体外受精与核移植动物手术法:将同期化处理后的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，将吸有胚胎的胚胎移植管（图13-1）插入穿刺孔，小心将胚胎输入。这种方法移卵容易、损伤小、成功率较高。羊等小家畜非手术法:使用类似于人工授精的专用输胚枪，将其直接插入排卵侧子宫角内，注入胚胎。牛马大家畜非手术法手术法13体外受精与核移植动物（6）体内发育、出生胚胎移植后处理与观察：胚胎移植后需补充黄体酮，目前多采用注射法给予黄体酮。胚胎移植后14天，可由验尿或抽血确定是否妊娠。如果确定妊娠，则改用hCG人绒毛膜促性腺激素继续补充到怀孕10周。妊娠后14天，B超检查胎儿数及胚胎着床部位。免疫胶体金法13体外受精与核移植动物13-3试管婴儿试管婴儿（Test-tubebabyy）是指将卵子与精子取出在体外受精，培养发育成早期胚胎，再植回母体子宫内发育出生的婴儿,也就是采用体外受精联合胚胎移植技术培育的婴儿。13体外受精与核移植动物试管婴儿的培育流程良好男性供体人工取精女性供体的超排卵人工受精

受精卵采集 胚胎体外培养女性受体选择与胚胎移植 体内发育与后代降生13体外受精与核移植动物莱斯莉·布朗和约翰·布朗是英国一对不孕夫妇。1977年夫妇向试管受精技术先驱罗伯特·爱德华博士及帕特里克·斯特普托博士求助。1978年7月25日，世界首例试管婴儿路易斯·布朗在英国诞生。成为当年全球媒体竞相报道的头条新闻6年后，布朗夫妇二度借助试管受精技术，再添一女。13体外受精与核移植动物现在LouisBrown路易斯在邮政部门工作，2004年9月4日，路易斯与时年34岁的安保部门官员韦斯利·姆林德喜结连理。13体外受精与核移植动物1988年3月10日我国第一个试管婴儿诞生

来自全国各地的试管婴儿欢聚一 堂，为郑萌珠庆贺生日1987年5月，甘肃礼县盐关镇的郑桂珍老师来到北京城，希望做母亲的

愿望得以实现。

截止2006年世 界诞生300万试 管婴儿。著名的产科专家北京三院张丽珠教授怀抱刚出生的试管婴儿郑萌珠2000年，我国首例超快速冷冻胚胎移植的 试管婴儿在湖南医科大学诞生。13体外受精与核移植动物华兹（Ed第一代试管婴儿：主要特征是模拟体内受精过程，将精子与卵子通过共培养完成受精。1977年，爱德 （Edwards）和斯蒂普特(S特(Steptoe))创造的试管婴儿为第一代试管婴儿。第二代试管婴儿：是指采用显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内受精培育的婴儿。由于使用的是非自然选择的精子进行受精，因此可能将遗传缺陷传给下一代，同时显微授精操作容易造成卵细胞损伤。第三代试管婴儿：经过种植前胚胎遗传学基因诊断培育出的试管婴儿被称为第三代试管婴儿。取出部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎。13体外受精与核移植动物第四代试管婴儿◆借助别人卵浆增强自己卵子活力◆特征：卵浆置换◆主要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性13体外受精与核移植动物

超数排卵•在月经周期第3-9d时，利用促性腺激hMG或CC药物素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个 过程就称为超数排卵（superovulation）•

意义：让每个供体提供更多的胚胎13体外受精与核移植动物视频学习网站体外受精30/151244.shtml试管婴儿试管婴儿制作流程（1）http://（2）（3）（4）（5）13体外受精与核移植动物13-4核移植动物13体外受精与核移植动物一定义细胞核移植（Cellnucleartransfer）是利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。细胞核移植动物：是用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到受体，发育出生的动物。理论基础：动物细胞核具有发育成个体的全能性，因此克隆动物可以通过细胞核移植实现。但是，细胞核移植所得到的动物为核质杂种。克隆动物一般指采用核移植、胚胎移植技术得到的动物。13体外受精与核移植动物二核移植动物培育技术流程1-核供体细胞的获得与取核2-受体细胞的去核3-细胞核移植4-重组胚的激活、培养和移植5-核移植后代的鉴定13体外受精与核移植动物1核供体细胞获得与取核供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行1～5天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入G0期）。采用细胞松弛素B（CytochalasinB）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。13体外受精与核移植动物2受体细胞去核（1）盲吸去核法：用微细玻璃管吸除处于MII分裂中期的卵细胞染色体及周围的部分细胞质。

用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率。（2）功能性去核法：使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后，用紫外线或激光定点照射使核功能丧失。（3）化学诱导去核法：使用脱羰秋水仙素处理卵细胞，迫使核染色质全部进入第二极体细胞。13体外受精与核移植动物3细胞核移植细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。前者是用微吸管吸取供体核后，直接注射进卵子细胞质。后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中。13体外受精与核移植动物核移植方法将受体卵细胞去核移植后的细胞激活后可以象受精卵一样发育形成动物个体，并具有与核供

体细胞相同的基因向去核卵细胞植入供体细胞核核移植与动物克隆13体外受精与核移植动物4重组胚激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而导致供核回复到初始状态，基因从头开始顺序表达。而核移植重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。（1）电激活：是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。（2）化学激活：常用的激活剂包括7%乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素等。锶13体外受精与核移植动物5重组胚培养和移植激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。（1）体内培养：是将重组胚移植入同种或异种受体动物的输卵管发育至桑葚胚或囊胚期(8-16cell)，再进行胚胎移植至受体动物子宫发育。（2）体外培养：是将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体动物中继续发育。6体细胞核移植后代的鉴定与出生对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术鉴定。13体外受精与核移植动物三胚胎细胞克隆动物13体外受精与核移植动物五体细胞克隆动物体细胞克隆：是将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，培育成早期胚胎，将胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。意义：由于体细胞数量丰富并且易于获得，因此体细胞克隆动物技术在加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物（如大熊猫），也可以用患者本人细胞培育出干细胞或新组织治疗方面意义重大。13体外受精与核移植动物体细胞克隆基本过程13体外受精与核移植动物里程碑式的突破－1997年，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞，通过核移植克隆了一只雌性小绵羊——Dolly多莉。这是第一个体细胞克隆动物。证明：成熟的体细胞也具有全能性。13体外受精与核移植动物多莉羊技术路线13体外受精与核移植动物1-核供体细胞获得与取核取一只6岁已妊娠到后期的白色的芬兰多特西母羊的乳腺组织，酶消化分解成单个细胞，将这些细胞平铺在新鲜的细胞营养层（滋养层）上培养7天，将这些细胞转移到却乏营养的培养基上培养传代，其培养基的胎牛血清浓度从10%下降至0.5%，这样使细胞停在休止期（G0）。（传到7-9代时，供体细胞可停在休止期，此时细胞染色体为54个，是二倍体）。在倒置显微镜下，用显微吸管将核吸出。13体外受精与核移植动物2-卵细胞收集与去核受体卵细胞来自于苏格兰黑面母绵羊，在注射促性腺释放素(GnRH)28-33h时，收集卵细胞。在倒置显微镜的视野下用显微吸管刺入，吸取中期染色体和少量细胞质。去核后卵细胞放在无钙镁，但含有1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中复原，然后转移到37度无钙、但含有10%的胎牛血清的M2培养液中保存备用。3-细胞核融入卵细胞构建重组胚将核和已去核卵细胞放入同一培养皿中，在交变脉冲电压为3伏的电场中融合5分钟，再用1.25千伏/厘米，80微秒，直流电脉冲3次，将乳腺细胞核融入卵中形成一个含有新遗传物质的卵细胞，称之为重组胚。13体外受精与核移植动物4-重构胚的培养与移植将重构胚种植在绵羊结扎的输卵管中培养，大约培养6天后，大多数胚胎发育到桑椹期或囊胚期（8－16个细胞）。再选择发育优良的重构胚移植到苏格兰黑绵羊的子宫中，每只受体母羊移植1-3个重组胚。5-妊娠发育监护与出生妊娠60天时用超声波诊断妊娠。每两周进行一次全方位监护胎儿发育。分娩时由兽医外科医生助产。产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。13体外受精与核移植动物猕猴特拉2000年成功克隆了一只叫做特拉的猕猴13体外受精与核移植动物克隆猪2000年美国一家生物公司克隆了5头雌性猪，用于生长出适合人类的器官和细胞组织。13体外受精与核移植动物老鼠库姆利纳2000年美国成功克隆一只老鼠，这只老鼠被命名为“库姆利纳”

(Cumulina)，它一直存活了两年7个月。13体外受精与核移植动物母牛诺托和卡加1998年日本成功克隆两头母牛，随后克隆了数千头母牛，为生产出更好的肉质和牛奶。13体外受精与核移植动物兔子2001年科学家成功克隆出兔子。13体外受精与核移植动物克隆猫科毕2001年成功克隆，从此开辟了宠物克隆市场。13体外受精与核移植动物克隆马普罗梅蒂亚2003年意大利克隆出一只叫做普罗梅亚的种马。13体外受精与核移植动物克隆鹿杜威2003年美国德克萨斯州农业机械大学成功克隆了一只白尾鹿，并取名为杜威。目的是用于研究鹿基因，并形成更好的鹿基因。13体外受精与核移植动物克隆狗史努比2005年韩国科学家利用干细胞移植手术培育出世界上第一只克隆狗，并将这只克隆狗命名为史努比。13体外受精与核移植动物13-5冷冻保存技术

1.胚胎冷冻技术

2.精子冷冻技术

3.卵细胞冷冻保存技术13体外受精与核移植动物

1.胚胎冷冻技术◆关键是减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤◆抗冻保护剂（1）渗透型细胞内冷冻剂：甘油、DMSO、乙二醇等，进入细胞排除细胞水份，降低电解质浓度，提高了细胞耐冻性。（2）非渗透型细胞外冷冻剂：改变渗透压引起细胞脱水，包括葡萄糖、蔗糖、棉子糖、PVP等。◆冷冻保护液：常用pH7.2-7.4PBS或生理盐水或M199来配制。◆冷冻方法：玻璃细管缓慢冷冻法

玻璃化冷冻法：由于冷冻剂溶液在低温时变粘稠，形成一种特殊的无定形“玻璃化”固液之间状态，细胞内外水份都不形成结晶损伤，从而使胚胎在急剧的降温过程中得以存活。复苏：解冻时则以较快的速率升温（快融），使胚胎瞬间通过危险温区（-50-0℃），然后脱除对胚胎细胞有一定伤害作用的冷冻保护剂。13体外受精与核移植动物

2.精子冷冻保存◆常温保存：15~25℃

低温保存：0~5℃

冷冻保存：-79℃干冰、-196℃液氮

3.卵细胞冷冻保存◆比胚胎和精子保存难度大◆常采用两步法玻璃化冷冻保存法13体外受精与核移植动物13-6动物性别控制所谓性别控制，就是通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。多数动物的性别是由性染色体决定的。以人为例：XX——女；XY——男在人Y染色体短臂发现了一个单拷贝基因，称为Y染色体性别决定区基因（SexdeterminingregionYgene，SRY）Y染色体短臂上一段SRY基因决定人的性别。SRY基因启动雄性器官的发育。XX染色体缺少SRY基因，染色体上DSS位点基因转录促进卵巢发育，形成雌性。性别决定机制13体外受精与核移植动物性别控制途径性别控制主要有两条途径：1-受精前性别控制：选择X、Y精子2-胚胎移植前性别控制：在移植前对胚胎进行性别鉴定，然后对所需要性别的胚胎进行移植，从而达到控制后代性别的目的，这是动物性别控制较为实用的方法。

选择相应的X或Y雄性配子，进行体外受精，就可以实现性别控制。13体外受精与核移植动物X-Y精子在物理和化学上存在差异，例如：精子的耐酸碱性：Y精子有嗜碱性，而X精子有嗜酸性。可以采用以下方法分离X/Y精子：（1）离心分离法X精子DNA含量略大于Y精子，因此X精子密度较Y精子略大，因此可以采用离心分离。优点：是分离时间短、对精子损伤小。缺点：是因为X、Y精子密度相差不大（0.007g/m3），分离困难，对仪器精度要求高。1-受精前性别控制：X-Y精子的分离13体外受精与核移植动物（3）电泳分离法利用精子表面电荷差异采用电泳进行分离。精子带负电荷，Y精子负电荷略小于X精子，因此在中性缓冲液中，X精子向阳极移动的速度较快。优点是操作方便，缺点是分离效率不高。（2）免疫学分离法Y精子上存在雄性特异性组织相容性抗原（H-Y抗原），利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在HY抗原，以此分离X精子（H-Y抗原阴性）和Y精子（H-Y抗原阳性）。主要有免疫亲和柱层析法和免疫磁珠法。目前这个方法仅限于小规模实验研究，准确性较低。13体外受精与核移植动物（4）流式细胞仪分离法根据X、Y精子上DNA含量的微小差别，通过流式细胞仪(Flowcytometer)进行分离。首先将精子稀释并与荧光染料Hoechst33342混合，这种染料可以定量地与DNA结合。精子通过检索仪时被激光束激发，由于X精子比Y精子含较多的DNA，X精子放射出较强的荧光信号。放射出的信号通过计算机系统分辨X精子和Y精子。借助两块各自带正电或负电的偏斜板，把X或Y精子分别引导到2个收集管中。13体外受精与核移植动物2胚胎移植前性别鉴定细胞生物学方法：通过判定胚胎细胞性染色体是Ｘ还是Ｙ来鉴定胚胎的性别。分子生物学方法：根据Y染色体上的SRY基因的有无进行鉴别，可以采用PCR或FISH等分子方法进行确定性别。生化免疫学方法：H-Y抗原检测法13体外受精与核移植动物对于人类，世界范围内不孕夫妇占10％左右，中国约有4000万夫妇不能孕育，需要建立人工助孕技术。视频：体外受精婴儿30/151244.shtml动物人工繁殖的技术方法一览：13体外受精与核移植动物体细胞、成体干细胞雌性动物雄性动物核移植卵子精子人工授精体外受精胚胎重组胚有性生殖途径无性生殖途径

胚胎细胞胚胎培养胚胎冷冻胚胎分割胚胎移植 受体动物 发育出生13体外受精与核移植动物克隆有关伦理学问题讨论13体外受精与核移植动物讨论题：1-动物可以无休止地被克隆吗？2-你是否同意生殖性克隆？无性生殖是否是人类的倒退？3-英雄、伟人可以通过克隆再生吗？13体外受精与核移植动物问题1：克隆羊多莉刚出生时，它的染色体显示已经有好几岁了。2003年它已经永远离开了我们。6岁。供体6岁。苏格兰罗斯林研究院的科学家们对多莉的染色体做了仔细的研究，发现其染色体末端端粒比同龄的普通绵羊短。端粒是决定细胞老化的主要因素，端粒越短的细胞越接近死亡。变短的端粒或许表明遗传的蓝本会随着时间流逝而老化，无休止地克隆一个动物是不可能的。13体外受精与核移植动物关于端粒每一条染色体的末端都有特殊的结构叫端粒(telomere)。它可以保持染色体的稳定性，丢失了端粒的染色体很容易和别的染色体相接形成双着丝粒染色体或自身首尾相联形成环状染色体，前者在减数分裂后期会产生染色体桥(chromosomebridge)，最终引起染色体的重复与缺失。13体外受精与核移植动物生殖细胞可以重建与延长端粒的DNA；而体细胞则随着复制次数的增加端粒DNA会逐渐缩短。Harley等（1989年）用人的端粒重复片段为探针对胎儿、新生儿、青年和老年人的细胞株的端粒长度进行了研究，发现随着年龄的增加，人成纤维细胞端粒的长度不断下降。因此端粒DNA可能决定了细胞的寿命，并与细胞的自然凋亡与癌变密切相关。1990年Harely等则认为端粒的长度可反映细胞有丝分裂的次数。端粒象是细胞分裂的“计数器”。13体外受精与核移植动物问题2：许多国家出台法律禁止生殖性克隆。有性生殖是历史进化的结果，利于种族繁衍和生存，以及优良性状的形成。选择无性生殖——克隆的方式不利于遗传多样性的保护。从有性繁殖到无性繁殖，就进化而言是一种退化。13体外受精与核移植动物克隆动物存在的问题 （1）技术尚不成熟得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出２７７个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。13体外受精与核移植动物（2）遗传、疾病问题克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统缺陷和心肺功能不健全的问题。克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。13体外受精与核移植动物（3）克隆人带来的社会、伦理学问题人类胚胎克隆与克隆人2001年研究人员将一枚卵细胞中的D