分子生物学考试资料

第一题：1) Replicon复制子是DNA复制是从一个DNA复制起点开始，最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。DNA中发生复制的独立单位称为复制子。2) leadingstrand前导链：与复制叉移动的方向一致，通过连续的5′-3′聚合合成的新的DNA链。3) transposableelement转座因子：又叫可移动因子，它是指一段特定的DNA序列，可从原来的位置上单独复制或自动脱落下来，经环化后再插入到染色体其他位置，并对插入位置的附近基因产生各种遗传学效应。4) proteome蛋白质组：蛋白质组是指组织或细胞中所有的蛋白质的集合。5) interruptedgene间隔基因或断裂基因（splittinggene）即真核生物的结构基因是由若干个外显子和内含子序列相间隔排列组成的间隔基因。6) trans-acting反式作用：DNA通过其产物(mRNA或蛋白质)间接调节基因的表达。Transcription转录，epigenetics表观遗传学，transcriptome转录组，metabolome代谢组,allele等位基因，cistron顺反子，muton突变子，recon重组子，lactoseoperon乳糖操纵子，insertionsequence(IS)插入序列，RNApolymeraseRNA聚合酶,retro-transposon反转录转座子，genome基因组，semiconservativereplication半保留复制,semi-discontinuousreplication半不保留复制,translation翻译,laggingstrand后随链,replisome复制体,telomerase端粒酶,sensestrand正义链,isoacceptingtRNA同工tRNA,antisensestrand反义链,promoter启动子,terminator终止子,intron内含子，exon外显子.1) genome基因组：基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。2) proteome蛋白质组，同上3) interruptedgene间断基因：真核生物结构基因的编码区被非编码区所间隔（同上）4) intron内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。5) exon外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列6) transposon转座子：直接或间接结合RNA聚合酶的反式作用因子transcription转录,epigenetics表观遗传学，transcriptome转录组，metabolome代谢组,cistron顺反子，mutant突变子，recon重组子，lactoseoperon乳糖操纵子，insertionsequence(IS)插入序列，pseudogene假基因，RNApolymeraseRNA聚合酶,cis-acting反式作用，replicon复制子，semiconservativereplication半保留复制,semi-discontinuousreplication半不保留复制,leadingstrand先导链,laggingstrand后随链,replisome复制体,telomerase端粒酶,CvalueC值,sensestrand正义链,antisensestrand反义链,promoter启动子,terminator终止子,transcriptionalunit转录单元第二题，谈谈在大肠杆菌中如何高效表达一个真核生物的基因？一个好的大肠杆菌系统应该满足：1.尽可能低的诱导表达；具有快速简便的诱导方式；能够高表达多种基因；易于进行克隆操作；能直接进行点突变和DNA序列分析而不要压克隆。表达载体应该能够独立复制，具有多个复制位点，便于进行筛选，具有很强的启动子和终止子。同时必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。有核糖体结合位点，所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。

将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核体系中；采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核生物没有RNA剪接功能的问题；构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将多肽切除。第三题：简述原核生物RNA聚合酶的结构以及每个亚基的功能。答：原核生物RNA聚合酶由五个亚基组成的分子量五聚体蛋白质。五个亚基分别为两条α链，一条β链、一条β'链和一条σ因子链。其中前四个亚基组成核心酶，核心酶加上σ因子称为全酶。α链：决定基因转录的特异性β链：与转录全过程有关β'链：结合DNA模板σ因子：辨认起始位点第四题，结合你的课题谈谈你将来课题研究中会用到哪些分子生物学技术手段，并谈谈每种技术方法的原理（至少谈4种方法）答：在将来的研究中我可能会用到以下技术（大家自己选四种就好了）：PCR技术，根据DNA分子在高温时会发生变性，两条双链分开；温度下降后会发生退火，两条双链重新结合这个原理。首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。整个PCR反应的全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步，可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n蛋白质免疫印迹技术（Westernblotting），原理：用电泳的方法来分离蛋白质，是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。SDS是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。步骤：1、蛋白提取；2、等蛋白浓度的配制；3、SDS过程；4、转膜；5、封闭与杂交；6、发光显色克隆基因分离技术中：应用核酸探针克隆目的基因。原理：把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选核酸凝胶电泳技术：自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。因为核酸带负电性，所以把所加的样品加到电源负极，使其顺着正极移动。限制性核酸内切酶技术：是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。因其能够定位在外源DNA片段上，并在特定的DNA位点进行剪切。所以可以用来剪切我们所需要的目的基因片段。细菌转化技术，细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。第五题，谈谈如何克隆一功能已知但序列未知的原核生物或者真核生物的基因?答：选择含有目的基因的组织或细胞，分离其mRNA，以分离的mRNA为模板，逆转录合成第一链cDNA,然后利用cDNA第一链末端（3’端）的发夹结构为引物合成第二链cDNA并与第一链形成双链cDNA,随后将合成的cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，构建cDNA文库，对于λ噬菌体构建的cDNA文库，把体外包装的噬菌体颗粒感染琼脂平板上的菌苔；若用构建的cDNA文库则把转化的细菌涂布在琼脂平板上，对于得到的每个噬菌斑或菌落中都含有一个被克隆的cDNA片段，再用硝酸纤维素膜或尼龙膜进行拷贝或复制，即把每个噬菌斑或菌落中的一部分核酸精确的从主平板印染到滤膜上。然后再进行筛选，完成该基因的克隆。其中在筛选目的cDNA时由于该基因功能已知，所以应该用功能结合法筛选。功能结合法筛选又分为噬菌体显示法，酵母双杂交法和酵母单杂交法。其中酵母双杂交法的原理如下：将编码某一蛋白X（诱饵bait）的DNA序列与DNA结合域（BD）的编码序列连接使其表达融合蛋白（BD-X），然后将待检基因（Y）的cDNA与DNA激活域（AD）的编码序列连接，使其表达融合蛋白（AD-Y），将两个融合基因所在载体共同转化酵母细胞（含报告基因上游激活序列USA）。若X与Y不能相互作用，则不表达报告基因，若X与Y相互作用，则使BD与AD靠近形成有效的转录激活子，激活报告基因的转录，因此，可通过报告基因的表达与否，筛选可与诱导饵X结合的目的基因Y。当然cDNA法克隆仅限于克隆蛋白质编码基因。第六题，一个真核生物的基因在大肠杆菌中不能得到高效表达，可能的原因有哪些？答：表达载体不够优化，稀有密码子表达不够高，真核生物外源基因的mRNA不够稳定，大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加，将表达产物降解，发酵条件不够优化，外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。第七题，原核生物RNA聚合酶是如何找到启动子的？真核生物RNA聚合酶与之相比有何异同？

答：大肠杆菌RNA聚合酶在σ亚基引导下识别并结合到启动子上。单独的核心酶也能与DNA结合，σ因子的存在对核心酶的构象有较大影响，极大降低了RNA聚合酶与DNA一般序列的结合常数和停留时间。RNA聚合酶可通过扩散与DNA任意部位结合，这种结合是松散的，并且是可逆的。全酶不断变化与DNA结合部位，直到遇上启动子序列，随即有疏松结合转变为牢固结合，并且DNA双链被局部解开。真核生物基因组远大于原核生物，它们的RNA聚合酶也更为复杂。真核生物RNA聚合酶主要有三类：RNA聚合酶I转录45SrRNA前体，经转录后加工产生5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA。RNA聚合酶II转录所有的mRNA前体和大多数SnRNA。RNA聚合酶III转录所tRNA，5SrRNA等小分子转录物。真核生物RNA聚合酶的转录过程大体于细菌相似，所不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能识别和结合到启动子上，而需要在启动子上有转录因子和RNA聚合酶装配成活性转录复合物才能起始转录。第八题，如何设计实验克隆原核生物的复制起点？答：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点,常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子。复制起点DNA区段的克隆方法：根据该原核生物的基因序列确定限制性内切酶，再利用这种限制性内切酶分别酶E.coliDNA和具有抗生素抗性基因的质粒DNA（例如Ampr），选择最小的E.coliDNA片段与DNA片段连接后，转化缺乏Ampr基因的受菌体(Amps)，接种于含有氨苄青霉素的培养基中，根据只有同时具有具有oriC和Ampr的重组DNA的菌落才能在含有氨苄青霉素的培养基中能正常繁殖的原则，选择能正常生长的单菌落，摇床过夜培养，提取质粒，酶切鉴定验证克隆到E.coli复制起点区的DNA片段，通过测序进一步验证克隆结果。第九题，一个基因如何产生多种不同类型的mRNA分子？

答：一个基因产生一种以上mRNA的方式主要有两种。第一种是：一个原初转录物含有一个以上的多腺苷化位点，就能产生一种以上的具有不同3ˊ末端的mRNA。第二种是：如果一个原初转录物含有几个外显子，那么，会发生不同的剪接，就会产生多种mRNA。此外，RNA编辑可以通过某些核苷酸的修饰，插入或缺失，产生不同类型的mRNA。

第十题，谈谈如何克隆一功能已知但序列未知的真核生物的基因答：1、由功能推知基因编码的氨基酸序列，进而得出密码子序列，最后得到基因的脱氧核苷酸序列，然后进行人工合成，用PCR技术增殖即可。2、Phagedisplay的基本操作过程为:(1)提取某一病原体基因组DNA,用超声波将DNA切割成500～1500的片段;(2)将片段末端用T4DNA聚合酶处理后,与载体DNA(p