DB11T 2023-2022 鱼类贝类环境DNA识别技术规范

DB11北京市市场监督管理局发布 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》鱼类贝类环境DNA识别技术规范GB/T6682分析实验室用水规从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNA，可一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，包括变性、退火、延2DP1/T2023—2022分类操作单元operatiomaltaxononic在系统发生学或群体遗传学研究中设定的特定标志，可鉴别生物分类单元般把碱基序列相似度不小于97%的OTU定义为一个物种。为高通量测序时区分不同样点来源的物种基因序列，在扩增引物5’端4鱼类贝类eINA识别程序图1鱼类贝类eINA识别程序5试剂和器具5.1试剂——消毒液：次氯酸钠和蒸馏水配制，有效氯浓度5.5%~6.5%(质量分数);——75%乙醇：无水乙醇和超纯水3:1配制，其中消毒用75%乙醇）；）；——蛋白酶K：酶活力单位为20；——乙酸铵（CH3COONH4——乙酸钠（CH3COONa·3H2O）；——脱氧核糖核苷三磷酸：脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟嘌呤三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸的等摩尔数混合物（各2.5×10-3m），——低温离心机：最高离心转速不低于13000rpm，温控范围低至4℃;d)河流型水体：参照SL219中水质监测断面6.2.2离岸样点：鱼类eDNA样品在水深<10m处水面下0.5m采集，水深≥10m处分水面下0.5m7.1.3剪刀和镊子用自来水和75%乙醇清洗，超纯水浸洗，烘干备用。7.2.1连接真空泵和抽滤器，用镊子取0.45μm孔径的混合纤维素酯滤膜置于玻璃滤膜台中央，盖上浴裂解3h，期间每隔0.5h进行间断性震荡；c)将裂解液转移到对应编号的新离心管中，加入等体积Tris饱e)转移上清液到对应编号的新离心管中，j)使用超微量紫外分光光度计检测总DNA浓度和质量，利用2.0%琼脂糖凝胶电泳分析DNA完也可采用符合5.1中要求的动物组织细胞DNA提取试剂盒完成，具体操作也可采用符合5.1中要求的柱式PCR产物纯化试剂盒完成，具体操作下游引物R：CATAGTGGGGTATC上游引物F：GGWACWGGWTGAACWGTW可参考附录A中列出的8碱基条形码参考序列进行添加，也可根据情况自行设计添加。不影响扩增PCR扩增体系包括PCR聚合酶、聚合酶缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、经8.1和8.2提对PCR扩增样品进行第二代高通量测序，利用分析软件对测序结果数据进行预处理，去除测b)去除读长上的引物序列，去除错配扩增序列，此步骤处理后一般仅留存35~45%的序列；d)去除测序深度较低的序列，即测序所得碱基总量小于10×的序列；e)去除由于测序读长限制导致的末端序列不稳定的部f)将前后两端的读长拼接成一条完整的序列，最低重叠碱基数一般设置为20bp；g)将拼接的序列进行去重复处理并排序，即删除相同的序列，每个序列仅保留一条；i)将筛选和处理后的结果输出fasta格式的序列文件保存。a)经筛选与处理的测序数据需使用相关生物信息学分析软件基于97%序列相似度进行聚类，获相似度和覆盖度均大于85%的OTUs；d)提取物种的分类信息，包括界、门、纲、目、科、属、种等界门纲目科属种1...b)样品采集完成后置于4℃保存、运输并确保在24h内完成抽滤，滤膜在a)抽滤所用器具规范灭菌和清洗，避c)DNA提取和纯化所用器具按规范灭菌，耗材一次性使用，避免交叉污染。d)确保纯化后的PCR产物纯度合格，按规定保存避免降解。123456789[1]HJ710.8-2014生物多样性观测技[3]DB43/T432-2[4]黄祥飞，陈伟民，蔡启铭.《湖[5]