氧自由基清除剂对急性肺损伤大鼠核因子-κB的作用及机制研究

氧自由基清除剂对急性肺损伤大鼠核因子—κB的作用及机制研究目的探讨氧自由基清除剂依达拉奉对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠核因子-κB（NF-κB）的作用及机制。方法将30只雄性SD大鼠随机分为3组（n=10）：对照组（A组）、模型组（B组）、依达拉奉组（C组）。B、C组大鼠腹腔注射脂多糖5mg/kg进行造模，A组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液5mg/kg进行对照。造模后C组大鼠腹腔注射依达拉奉10ml/kg进行干预，A、B组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液10ml/kg进行对照。6h后处死大鼠，抽取腹主动脉血液行血气分析测定血氧分压（PO2），用免疫组织化学法测定肺组织中NF-κB的含量，用ELISA测定TNF-α的含量。结果B、C组大鼠PO2低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠PO2的下降幅度小于B组，与B组相比，C组的PO2高，差异有统计学意义（P＜0.05）。B、C组大鼠NF-κB、TNF-α高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠NF-κB、TNF-α的上升幅度小于B组，与B组相比，C组的NF-κB、TNF-α低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论依达拉奉对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织起保护作用，其机制与抑制肺组织NF-κB的表达从而抑制肺部炎症反应有关。标签：自由基清除剂；急性肺损伤；核因子-κB急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）的临床特征为急性、进行性加重的呼吸困难、顽固性低氧血症和肺水肿。肺炎、胃食管反流、大量输血、休克、急性胰腺炎等疾病均可导致ALI的发生，并产生严重的后果。ALI的机制有很多，其中核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）参与许多细胞因子及炎症介质基因的转录调控，并起重要作用[1]。有研究表明NF-κB的活化参与了ALI的发病过程[2]。依达拉奉是一种新型的抗氧化剂和自由基清除剂，可以通过清除自由基抑制细胞膜脂质的过氧化[3]。依达拉奉作为临床上常用的氧自由基，是否可以通过对NF-κB的抑制达到缓解ALI症状的作用，本研究对此进行了探讨，现报道如下。1材料与方法1.1实验材料2012年11月～2013年1月，取雄性大鼠30只，体重200～300g，由长治医学院动物中心提供。将大鼠随机分为3组（n=10）：对照组（A组）、模型组（B组）、依达拉奉组（C组）。NF-κB（批号：bs-5660R）、TNF-α（批号：EK-0526）试剂盒及相应二抗均购于北京博奥森公司。脂多糖（批号：L2880）购于美国SIGMA公司，依达拉奉（批号：H20051992）购于吉林博大制药公司。1.2造模方法首先，B、C组大鼠参照李立斌等[4]、陈晓光等[5]的建模方法，以腹腔注射脂多糖的方式造模。B、C组大鼠腹腔注射脂多糖5mg/kg进行造模，A组大鼠为空白对照组，以腹腔注射0.9%氯化钠注射液5mg/kg进行对照。造模后C组大鼠腹腔注射依达拉奉10ml/kg进行干预，A、B组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液10ml/kg进行对照。1.3实验方法1.3.1动脉血氧分压PO2测定各组造模完成后6h处死大鼠，抽取腹主动脉血液1ml，测定PO2。1.3.2肺组织病理检查取大鼠肺组织进行光镜检查。1.3.3血浆TNF-α测定处死大鼠，抽取腹主动脉血液5～6ml，4℃离心（3000r/min，10min）后取上清液，置-70℃保存。用ELISA测定TNF-α的含量。1.3.4NF-κB的测定处死大鼠后，取右上肺组织，经4%多聚甲醛浸泡组织，4℃冷藏过夜后，经脱水、透明、石蜡包埋切片，行免疫组化法测定肺组织中NF-κB。使用BI-2000医学图像分析系统测定灰度值，抗体表达在肺组织的细胞质或核膜棕黄色染色为阳性信号，细胞质和核膜蓝染为不染色。1.4统计学分析所得数据均采用SPSS19.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1肺组织病理观察的结果与A组大鼠相比，B、C组大鼠肺组织明显肺泡出血、水肿，炎症细胞浸润，但是C组大鼠肺组织出血、水肿较B组轻，炎症细胞较B组少。2.2PO2、NF-κB、TNF-α数据的结果B、C组大鼠PO2低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠PO2的下降幅度小于B组，与B组相比，C组的PO2高，差异有统计学意义（P＜0.05）。B、C组大鼠NF-κB、TNF-α高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠NF-κB、TNF-α的上升幅度小于B组，与B组相比，C组的NF-κB、TNF-α低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。3讨论NF-κB是一类能与多种基因启动子部位的κB位点发生特异性结合并促进转录的蛋白质的总称。NF-κB是多种信号转导途径的汇聚点[6]，它通过调控许多重要的细胞因子，黏附分子和趋化因子的基因表达，而参与机体的各种免疫及炎症反应[7]。同时，在ALI中炎症介质造成肺血管内皮细胞的损伤，使肺微血管通透性增高，血浆蛋白质渗入肺间质，造成肺间质水肿。炎性细胞在趋化因子和黏附分子的作用下，移行入肺间质，继续释放炎症介质，最终造成肺泡上皮的损伤，气-血交换屏障破坏，肺水肿和肺组织炎症呈进行性加重。有研究表明[8-9]，NF-κB是炎症介质的上游调控基因，在ALI发病过程中起重要作用。所以，如果抑制了NF-κB的表达，是否能达到缓解ALI的症状，这就是本课题研究的方向。通过A、B组的PO2比较，可以看出B组大鼠的PO2较A组降低明显。同时结合病理切片可以看出，B组大鼠的肺损伤明显。张剑锋等[10]、田巍等[11]实验表明，内毒素诱发ALI大鼠NF-κB显著升高，同时伴有炎性因子的过度表达。所以，通过A、B组的比较，证明本实验腹腔注射脂多糖成功建立ALI大鼠模型。C组大鼠造模后腹腔注射依达拉奉进行干预，C组大鼠PO2的下降幅度小于B组，与B组相比，C组的PO2高。虽然C组也进行了造模，但是经过依达拉奉的干预后，C组大鼠的PO2较B组明显好转，说明依达拉奉达到了缓解大鼠PO2的作用。C组大鼠NF-κB、TNF-α的上升幅度小于B组，与B组相比，C组的NF-κB、TNF-α低，同样说明在经过腹腔注射依达拉奉后，NF-κB的表达减少，促炎因子TNF-α的含量也减少，而TNF-α的含量改变可反映其他炎症因子的改变情况[12]。上述数据说明，依达拉奉能缓解ALI症状，减少炎性因子的表达。对ALI的治疗中，阻断炎症介质的瀑布式反应可能成为治疗ALI的新靶点[13]。有研究表明，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以有效抑制NF-κB的活化[14-15]。而作为临床工作中常用的氧自由基清除剂依达拉奉，通过本研究证明其对脂多糖所致的ALI大鼠肺组织起保护作用，其机制与抑制肺组织NF-κB的表达从而抑制肺部炎症反应有关。[参考文献][1]AbrahamE.NF-κBactivation[J].CritCareMed，2000，28（1）：100-104.[2]SchwartzMD，MooreEE，MooreEA.Nuclearfactor-κBisactivatedinalveolarmacrophagesfrompatientswithacuterespiratorydistresssyndrome[J].CritCareMed，1996，24：1285-1292.[3]刁学军.依达拉奉治疗急性脑梗死临床疗效观察[J].中国基层医药，2012，19（20）：3092-3093.[4]李立斌，方强，李利.脂多糖诱导大鼠急性肺损伤时核因子-κB信号转导及盐酸氨溴索的作用[J].中华急诊医学杂志，2007，16（7）：694-698.[5]陈晓光，白涛，吴滨阳，等.谷氨酰胺对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织核因子-κB的影响[J].中华医学杂志，2008，88（23）：1648-1650.[6]邱海波，杨毅，周韶霞，等.核因子-κB在小鼠急性肺损伤中的作用[J].中华急诊医学杂志，2003，12（1）：15-17.[7]谢艳萍，王建春.核因子-κB与急性肺损伤[J].重庆医学，2003，32（1）：115-117.[8]WanF，LenardoMJ.ThenuclearsignalingofNF-kappaB：currentknowledge，newinsights，andfutureperspectives[J].CellRes，2010，20（1）：24-33.[9]LiuG，ParkYJ，TsurutaY，etal.p53attenuateslipopolysaccharide-inducedNF-kappaBactivationandacutelunginjury[J].JImmunol，2009，182（8）：5063-5071.[10]张剑锋，李超乾，磨静佳，等.甘草酸二铵对急性肺损伤大鼠肺组织糖皮质激素受体及核因子κB表达的影响[J].中华急诊医学杂志，2010，19（3）：245-249.[11]田巍，王彤，倪莉.七叶皂苷钠和甲基泼尼松龙对油酸制备急性肺损伤大鼠模型的干预对比研究[J].首都医科大学学报，2011，32（1）：116-120.[12]LaffeyJG，EngelbertsD，KavanaghBP.Injuriouseffectsofhypocapnicalkalosisintheisolatedlung[J].AmJRespirCritCareMed，2000，162（2）：399