细胞生物学实验讲义

目录

前H

实验室规则

教学日历

第一章细胞培养技术

第一节细胞培养的基本原理和技术........................................(1)

实验一细胞培养的基本技术..............................................(1)

实验二细胞培养用液的配制..............................................(10)

第二节细胞培养的方法..................................................(15)

实验三观察细胞........................................................(15)

实验四细胞的传代培养..................................................(19)

实验五细胞计数及活力测定..............................................(23)

实验六培养细胞的冻存和复苏技术........................................(25)

第二章细胞工程

实验七(1)细胞融合-聚乙二醇法..........................................(28)

实验七(2)细胞融合-电场法..............................................(31)

实验八动物染色体标本的制备与观察......................................(33)

实验九设计性实验......................................................(36)

附录一细胞培养实验常用设备............................................(38)

附录二关于实验习惯记分若干规定(试行).................................(39)

附录三显微镜及其使用..................................................(40)

附录四实验报告的书写..................................................(44)

附录五实验设计的意义、三要素和六原则.................................(46)

主要参考资料...........................................................(49)

第一章细胞培养技术

第一节细胞培养的基本原理和技术

细胞培养(cellculture)是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理

环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和

功能的方法。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和

发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的

发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中

很多是通过细胞培养来实现的。细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体完全

是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程也离不开细胞培养。正在倍

受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有

的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了关键的

核心作用。

实验一细胞培养的基本技术

【目的要求】

1.熟悉与细胞培养相关的几个概念。

2.掌握体外培养细胞的生存条件。

3.掌握培养用品的清洗和消毒原则。

4.初步掌握无菌操作的基本要领和操作要求。

【实验原理】

细胞培养是一种程序复杂、要求严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须

模拟体内环境，供给细胞生存所必须的条件，如水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖、

生长因子等，还要受到温度、渗透压、pH等多种因素的影响。细胞培养用品的清洗、培

养用液的配制、除菌等均有严格的要求，特别是无菌操作，是细胞培养成败的关键。本

实验分两部分进行，理论部分重点介绍培养用品的清洗和消毒，无菌操作的基本要领和

要求，以及培养液的配制；实践部分分别在细胞培养准备间、细胞培养间进行。

【实验用品】

超净工作台，CO?培养箱，电冰箱，离心机，倒置相差显微镜，普通显微镜，水纯化装

置，抽滤装置，电子天平，液氮罐，洗刷装置，各类培养用品等。

11

//II\111I

500ml2000ml

无菌抽滤装置

co?培养箱倒置相差显微镜

水纯化装置培养用品

【内容与方法】

(一)与细胞培养相关的几个概念

1.细胞培养(cellculture)

细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生理环境，在无菌、适当温度及酸碱度

和一定营养条件下，生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。

2.传代(passage)

细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。

3.原代培养(primaryculture)

从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。原代培养的细胞生长比较缓慢，

而且繁殖一定的代数后(一般10代以内)停止生长。

4.传代培养(sub-culture)

在体外培养条件下，将细胞从一个培养器皿转移到另外一个培养器皿即称为传代或

传代培养。分离一次再培养称为传一代。

5.细胞系(cellline)

原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。

(二)培养细胞的生存条件

体外培养细胞所需要的生存条件和物质代谢过程与体内细胞基本相同，但随生存环

境的改变也会出现一定的差异。

1.水的质量

体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。配制培养用液应使用经石

英玻璃蒸储器三次蒸储的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，

存放时间一般不应超过2周。

2.无菌环境

防止污染是保证细胞在体外生存的基本条件之一。

3.温度

适宜的温度是保证细胞在体外生存的重要条件，人和哺乳动物的细胞最适宜的培养

温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。

4.渗透压

对大多数细胞来说，渗透压在260〜320mmol/L(260〜320mosm/kg)范围适宜。

5.pH条件

多数培养细胞的适宜pH值为7.2~7.4o

6.气体条件

和C02是细胞生存的重要条件。

7.营养条件

多种培养基。

8.培养基质

即细胞附着底物，包括培养瓶、培养皿等。

(三)培养器皿的清洗和消毒

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器械、塑料制品、橡胶制品、布

类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须

的。

1.清洗

离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留

物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不

含任何残留物的要求。

1.1玻璃器皿的清洗一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。

a.浸泡一一新的或用过的玻璃器皿都要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻

璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5%盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往

附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

b.刷洗一一将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死

角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

c.浸酸一一浸酸是将上述器皿浸泡到清洗液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作

用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸时间不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器

皿要小心。

清洗液可根据需要，配制成不同强度，常用的有以下三种：

强液：重铭酸钾63g,浓硫酸1000ml,蒸储水200ml

次强液：重铭酸钾120g,浓硫酸200ml,蒸储水1000ml

弱液：重铭酸钾100g,浓硫酸100ml,蒸储水1000ml

新配制的清洗液为棕红色，经多次使用后水分增多或遇有机溶剂时成为绿色，表示

清洁液已失效，需重新配制。

d.冲洗一一刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干

净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注满

水一倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2—3次，晾干或烘干后包装备用。

1.2橡胶制品的清洗

新购置的橡胶制品先用自来水冲洗后，再做常规处理。方法如下：用2%NaOH煮沸

15分钟，流水冲洗，再用1%HC1浸泡30分钟，流水冲洗，蒸储水漂洗2〜3次，最后

重蒸储水漂洗1次，50℃烤干或晾干备用。用过的橡胶制品的清洗方法基本同清洗玻璃

器皿，但胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，应逐个刷洗。

1.3塑料制品的清洗

塑料制品的特点:质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序一一器皿使用后立即用清水清洗，自来水浸泡过夜，用纱布或棉签和50℃

清洁液刷洗或超声波清洗机清洗后，流水冲洗，晾干，浸于清洁液（浸酸）15分钟，流

水冲洗15—20遍，蒸储水浸洗三次，重蒸水泡24小时，晾干备用。

2.包装

对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材

料有牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大的培养皿、特制的消毒筒等，近几年使用铝

箔作为包装材料，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装

入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

3.消毒和灭菌

微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，消毒和灭菌的常用方法有：

3.1物理消毒法

3.1.1紫外线消毒

紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次

是阳性菌，再次为芽抱，真菌抱子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是诱导胸腺喀咤二

聚体的形成和DNA链的交联，抑制DNA的复制，通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使

其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用

法简单，效果好。

紫外线不仅对皮肤、眼睛有伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，

不要开着紫外灯进行操作。

3.1.2电离辐射灭菌

以放射性核素产生的Y射线或电子加速器产生的加速粒子辐照物品以杀灭微生物

的方法。其优点是灭菌时物品不会升温，尤其适用于不耐热的物品；辐射的穿透力强，

可直接对密封包装的物品进行灭菌。

3.1.2高温湿热灭菌

压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿

透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、玻璃器皿、金属器械、橡胶和某

些培养液都可以用这方法灭菌。不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的

有效消毒压力和时间不同。

3.1.3高温干热灭菌

干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90—120分钟，杀死

细菌和芽抱，达到灭菌目的。主要用于玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）和不能

与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）的灭菌。干热灭菌后要关掉开关，并使物品逐渐冷

却后打开箱门，切忌立即打开，以免温度骤变，使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品

间要有空隙，物品不要靠近加热装置。

烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘

进行烧灼消毒。

3.1.4过滤除菌

将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除

菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前,

大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

3.2.化学消毒法

常用的消毒液有以下几种：

70%（或75%）酒精：超净台里常备70%酒精棉球，用于手和一些金属器械或工作

台面的消毒。

0.1%新洁尔灭（苯扎澳胺）：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。

超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。

0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10min即可将芽抱菌杀死。用于各种物品的表面

消毒，用喷撒和擦拭方式进行。

乳酸蒸气：将乳酸放入生锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1一3d„

可将空气中漂浮的微生物杀死。

3.3抗生素消毒

抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生

物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

综上所述，可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围

（表1）,应根据不同情况选择合适的方法。

表1常用消毒方法及选择

物品名称压力蒸汽干热过滤紫外线化学气体化学消毒剂电离辐射抗生素

培养室+++

工作台+++

玻璃制品+++

金属器械++++

塑料用品+++

橡胶制品++++

培养用液+++

棉布类++

（四）培养操作的基本要领和要求

1.超净工作台的消毒

工作面和超净台内面先用70%酒精棉球擦拭一遍，打开紫外线灭菌，直接照射20~

30min后，关紫外灯。打开风机运转10分钟后，才可开始实验操作。

2.培养前的准备

根据实验的要求进行物品的清点和包装，注明标签后灭菌、烤干备用。在消毒前移

入培养间或超净工作台。

3.洗手和着装

先用流水冲洗，再用70%酒精棉球擦拭。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。

4.火焰消毒

在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开

瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。注意金属器械不能在火焰上

烧灼时间过长，以防退火。烧过的用具要待冷却后才能夹取组织，以免造成组织损伤。

5.培养操作

在进行培养操作时，动作应准确敏捷，但不必太快，以防空气流动，增加污染机会。

不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。培养用液不要

过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。不要在打开的容器正上方操

作（垂直层流超净台）。容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身或放置在特制瓶架上，倾

斜约45。取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上（若需放置,应放在开口的瓶子后面）。

吸取不同培养液时，应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。

工作中不要面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运

转10分钟后，才可进行下一个实验操作。

无菌操作工作区域应始终保持清洁与宽敞,必要物品，如试管架,移液器或吸管头等

可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用70%酒精

擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,不要在净化

气流和外界气流界面处进行操作。使用完毕后，将不用物品全部移走，然后用70%酒精

棉球将台面和台内四周擦拭干净。

为便于拿送物品，工作台面上的用品要有合理的布局。原则是：右手使用的东西放

置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。

【注意事项】

1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞

粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则

损害塑料表面后细胞不易贴壁。移液器枪头和微量离心管一定要用超声清洗处理后逐个

清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。

2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时,

不能再打开烤箱门。器皿烘完后，待温度降100℃至以下才能开烤箱门。金属器械、橡

胶和塑料制品不能使用干热灭菌方法。.

3.高压灭菌开始前要把冷空气排尽，灭菌后要待压力降到“0”时才打开排气阀；高压灭

菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。

4.紫外线灭菌时，不要让紫外线照射人的皮肤。

5.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂（如TdR、秋水仙素、谷氨酰胺，异硫

氟酸服、MOPS等）是有机溶液，均不能高压。

6.滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高

压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜

过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过

滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能

进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。

7.来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先

准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角

膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。

【思考题】

1.简述体外培养细胞的生存条件。

2.简述培养用品的清洗和消毒灭菌的方法。

3.为什么灭菌器内需要灭菌的物品不能摆的太密？

4.干燥箱灭菌的温度是多少？灭菌结束后要注意什么？

5.比较干燥箱灭菌和高压灭菌器灭菌的优缺点，并说出原因。

实验二细胞培养用液的配制

【目的要求】

1.了解细胞培养用液的种类。

2.熟悉细胞培养用液的配制。

3.熟悉合成细胞培养基的配制。

【实验原理】

细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指

所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长

的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生

长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、

无机离子及其他一些核酸降解物、激素等。

【实验用品】

H20,青霉素，链霉素,干粉培养基，胰酶,NaHCO3,NaCLKCLCaCl2,MgCL,

MgSOi,Na2HP04,NaH2P04lKH2P04,酚红，葡萄糖，NazHPOj12HQ

【内容与方法】

培养用液主要有三大类：平衡盐溶液，常用基本试剂和培养基。

（一）平衡盐溶液（BSS）

平衡盐溶液主要是由无机盐和葡萄糖组成，具有维持渗透压，调节酸碱平衡，为细

胞生存提供所需能量和无机离子等成份。还可以用作洗涤组织细胞，配制各种培养用液

的基础溶液。平衡盐溶液内含有少量酚红作为pH变化的指示剂，溶液变酸时呈黄色，

变碱时呈紫红色，中性时呈桃红色。

目前常用的平衡盐溶液是Hanks液、PBS液和D-Hanks液等。以下是几种常用的平

衡盐溶液配制方法。

1.Hanks液：为了便于保存和减少有关成份化学反应，常配成浓缩液。方法如下:

1.1浓缩母液的配制（10X）法

A液:取400ml三蒸水依次溶解下列试剂：NaCl80g,MgSOj7H2O2g,CaCl21.4g,,

待完全溶解后，补足三蒸水至500ml。

B液:取450ml三蒸水依次溶解下列试剂，Na2HP040.6g(Na2HPO4«12H201.52g),

KH2P。40.6g,葡萄糖10g,0.4%酚红50ml。

1.2工作液配制法

取上述A、B液等量，用三蒸水稀释10倍，即成工作液，高压灭菌，4℃保存。例

如配制1000mlHanks液,则取三蒸水900nli加入A液50m1、B液50ml混匀，用4.5kg

(114℃)高压灭菌15min。临用时，用7.4%NaHC()3溶液调至所需pH值。

2.PBS液：可配成含0.85%NaCl,pH7.2的PBS。

2.1PBS储存液(10X)配法

NaCl8.5g,KC10.2g,Na2HP04»12H202.85g(或NazHPOjZHzO1.13g),KH2P(h0.27g,

溶于100ml三蒸水中。

2.2PBS工作液配法:取储存液50ml加三蒸水450ml即成，高压灭菌，4℃保存。

3.D-Hanks液

为无钙镁的Hanks液，可用于配制消化液和洗涤细胞用液。具体配方：NaCl8g,KC1

0.4g,Na2HP04»H200.06g,KH2P040.06g,NaHCOs0.35g,酚红0.02g。各成份依次溶解

于500nli三蒸水中，待完全溶解后，补足三蒸水至1000ml。

(二)基本试剂

基本试剂主要有：用来分散细胞，制备细胞悬液的消化液，调整各种培养用液酸碱

度的pH调整液，防止培养过程中发生污染的抗生素和指示液体酸碱度(pH)的酚红溶

液。

1.消化液：最常用的是0.25%的胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA),它们可以

单独使用，也可以按一定比例混和使用。

1.10.25%胰蛋白酶：0.25g胰蛋白酶粉加入100mlD-Hanks液，完全溶解后，过

滤除菌，调整pH至7.4,密封后4℃冰箱保存。

1.20.02%EDTA液:EDTA0,2g加入D-Hanks液1000ml,高压灭菌，用前调整pH

至7.4,4℃冰箱保存。

2.pH调整液：用来调整各种培养用液pH值，通常单独配制。

2.17.4%NaHCOs溶液：7.4gNaHCOs加入三蒸水至100ml,完全溶解后过滤除菌，

密封4℃冰箱保存。

2.2lmol/LHC1：37%HC18.4ml,加三蒸水至100mL过滤除菌，密封4℃冰箱

保存。

2.3HEPES液:用来维持培养液恒定的pH的缓冲液。使用的终浓度为10~50mmol/L„

配液时可直接加入到培养液中（1000ml培养液中加入2.38gHEPES,终浓度为10mmol/L）,

滤过除菌后使用。也可以单独配制成100X储存液（lmol/L）,过滤除菌后使用。

3.抗生素液：在培养液中加入适量的抗生素，可预防操作不慎产生的污染。常用的

有青霉素，链霉素，庆大霉素等。它们使用的浓度分别为青霉素100u/ml,链霉素100

ug/ml,庆大霉素50〜100u/mlo将抗生素溶于三蒸水中，配成100或200倍储存液，

分装于小瓶内，一20℃保存，配液时加入。

4.0.4%酚红溶液：称取酚红0.4g,在玻璃研钵中研细，逐渐加入0.Immol/LNaOH,

边滴边研至酚红完全溶解，共加至11.28ml为止，将研好的酚红液移入烧瓶中，加三

蒸水88.72ml。114℃高压灭菌15min,4℃保存。

（=）合成培养基

现在普遍使用的是合成培养基，它是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、

人工设计、配制的培养基。合成培养基有一定的配方，其主要的成份是平衡盐溶液加氨

基酸和维生素类，是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种，有的培养基

仍在不断进行改良。对于动物细胞来说，合成培养基只能维持细胞的生存，要使细胞更

好的生长和繁殖，还需补充天然培养基，主要是小牛血清。通常在合成培养基中加入

10%〜20%的小牛血清。

目前常用的合成培养基有MEM细胞培养基系列、DMEM细胞培养基系列、RPMI-1640

细胞培养基系列、199细胞培养基系列、F-10、F-12细胞培养基系列等。配制方法基本

相同，基本步骤如下（以配制1000ml培养基为例）：

1.称取青霉素15mg,链霉素100mg,取1袋干粉培养基（配1000ml量）或按说明

书准确称取干粉培养基（如RMPH640为10.4g）,溶于800ml三蒸水中，轻轻搅拌，不

要加热（水洗包装袋的内部，转移全部的干粉到容器内）。待充分溶解后加入7.4%NaHCOs

溶液调节pH值至7.2±0.2,再移入1000ml容量瓶，加三蒸水至1000ml。

2.用已灭菌的滤器过滤除菌。

3.分装在无菌瓶中，密封，-20℃保存。

4.用前于37℃水浴锅内解冻，添加已灭活的血清，4℃保存（短期内使用）。

【注意事项】

1.配制培养基要注意以下问题：

•认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHC%、谷氨酰胺、丙

酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHC%,有些则根据实验需要决定。

・配制时要保证充分溶解，NaHCOs等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。

•配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。

•所用器皿应严格消毒。

・配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于一20℃。

2.血清的使用与储存

•使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃30分钟。灭活的目的是去

除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细

胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，这样做的前

提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经

灭活直接用于细胞培养。

・储存条件：血清一般储存于一20℃,应避免反复冻融。购买大包装的血清后，首先要

灭活处理，然后分装成小包装，储存于一20℃,使用前融化。融化时最好先置于4℃。

融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。

•使用浓度：一般为5—20%,最常用的是10%。过多血清容易使培养中的细胞发生变

化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。

・采购血清时，最好先从供应商处索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6

个月至1年的量，直至用另一批经过预先试验的样品代替。

3.BSS的pH值应确定为7.2左右。

4.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100ml的CaCL与含有其他成分的

液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液

体变混。

5.胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4℃

左右。

6.胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。

7.胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷

冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污

染。

【思考题】

1.简述合成培养基的基本配制方法。配制培养基时调节pH值的目的是什么？

2.简述血清如何使用与储存。血清在细胞培养中有何作用？

3.D—Hanks液的主要用途是什么？

4.配制胰酶消化液时应注意哪些问题？

第二节细胞培养的方法

实验三观察细胞

【目的要求】

1.了解细胞接种后的一般生长过程。

2.掌握如何使用显微镜观察细胞。

3.简单了解培养细胞形态特征。

【实验原理】

一般单层培养的细胞，从培养开始要经过生长、繁殖、衰老和死亡的连续过程。可

将其分为游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰退期五个时期，但各期之间无绝对的界

限。一般在对数生长期进行传代，以保持传代细胞良好的生长增殖活性。

人和动物体内的细胞有复杂的形态结构和功能，当它们离体后在体外培养时，由于

脱离了体内特定的环境，形态上往往表现单一化。体外培养细胞大致分为上皮细胞型、

成纤维细胞型、游走型和多形型四种类型。

【实验用品】

1.器材：倒置显微镜，光学显微镜

2.材料：人肝癌BEL-7402细胞，PC12细胞

【内容和方法】

（一）单层培养细胞的生长过程

（1）各期细胞主要特点

从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间为一代。该过程细胞要经过生长、繁殖、

衰老及死亡的连续过程。可将其分为以下五个时期：

1.游离期：细胞经消化分散后，由于原生质收缩和表面张力以及细胞膜的弹性，

细胞变成圆形，折光性强，呈悬浮状态，此期可延续数小时。

2.吸附期：单细胞悬浮静置培养一段时间（不同细胞所需的时间不同），由于细胞

的吸壁特性，开始贴壁，24h后大部分细胞均已贴壁，圆形细胞变成延展状态，细胞立

体感强，细胞质颗粒少而透明。

3.繁殖期（生长期）：此时细胞快速生长和分裂（可见有许多折光性强的圆形细胞）,

细胞数目增多，由几个细胞形成细胞岛（由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群）到

形成良好的细胞单层。此期细胞形态为多角形（呈现上皮样细胞的特征），细胞透明，

颗粒少，细胞间界限清楚，可见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可

将其生长状态分为四级：常以“十”多少表示：

+：细胞占瓶壁有效面积的25%以内

++：细胞占瓶壁有效面积的25%〜75%以内

+++：细胞占瓶壁有效面积的75%〜95%,并具有新生细胞。细胞排列致密，但仍然

有空隙。

++++：细胞占瓶壁95%以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。

从++〜++++为细胞对数生长期。

4.维持期：细胞形成良好单层后，生长和分裂速度开始减慢，折光性强的圆形细

胞减少，逐渐停止生长（即出现密度抑制现象）。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒

增多，透明度降低，立体感较差。由于细胞代谢物的积累，C0,增多，培养液逐渐变黄。

5.衰退期：当细胞形成致密单层后，由于营养的缺乏，代谢物积累，细胞内颗粒

进一步增多，透明度更低，立体感很差。最后细胞皱缩，细胞质出现空泡，逐渐衰老死

亡，从瓶壁上脱落下来。

（二）观察细胞

1.光学显微镜观察细胞（略）。

2.倒置显微镜观察细胞

活细胞无色透明，当光波通过细胞时，颜色和亮度变化不大。倒置显微镜利用的是

细胞内结构密度的不同而对光产生折射率有差异的原理，使肉眼不能分辨的相位差变为

可分辨的振幅差（即明暗差）。

（1）暗反差

(2)明反差

(3)培养细胞的形态特征

体外培养的细胞根据它们的生长方式可分为贴附型和悬浮型两类。

粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

3.1贴附型

当细胞贴附于支持物上后，细胞在体内原有的特征，细胞分化现象常变得不显著。

在判定培养细胞形态时常难按体内细胞标准确定，仅能大致如下分类。

A.成纤维型细胞一一胞体呈梭形或不规则三角形，中央有核，胞质向外伸出2〜3

个长短不同的突起。

B.上皮型细胞一一这类细胞胞体呈不规则多角形，中间有圆形核，细胞紧密相连

呈单层。

C.游走型细胞一一细胞在支持物上散在生长，一般不连续成片。细胞质经常伸出

伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而不规则。此型细胞不稳定，有时亦难

以和其他型细胞相区别。

D.多形型细胞一一除上述三型细胞外，还有一些组织细胞如神经组织的细胞等，

难以确定它们规律的形态，统归为多形型细胞。

3.2悬浮型

细胞悬浮生长时，胞体为圆形，如淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞等。其优点

是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于传

代和做细胞代谢等研究。

上皮样贴壁细胞成纤维样贴壁细胞悬浮细胞

【思考题】

1.简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。

2.体外培养的细胞根据它们的生长方式可分为哪两类?各有什么特点？

3.倒置显微镜的工作原理是什么？

实验四细胞的传代培养

【目的要求】

1.掌握细胞传代的一般方法和步骤。

2.进一步熟悉培养过程中的无菌操作技术。

【实验原理】

当培养细胞长成致密单层后以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞

之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足

和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接

种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再

培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

由于细胞生长类型不同其传代方式也不同：贴附型生长细胞用酶消化法传代，而悬浮型

生长细胞用直接传代法或离心法传代。在这里我们必须掌握贴附型生长细胞的传代方

法。

【实验用品】

1.器材一一细胞培养瓶，吸管，移液管，各类橡皮吸头和胶塞，酒精灯，试管架,

酒精棉球

2.试剂一一DMEM培养基（含小牛血清和青、链双抗），0.25%胰酶溶液，Hanks

液

3.材料一一PC12细胞株

【方法与步骤】

（一）贴附生长细胞的传代

贴壁生长的细胞要用酶消化法进行传代，步骤如下：

1.洗细胞一一取已长成或接近长成致密单层的PC12细胞，倒去培养液，加入2〜

3mlD-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞后倾去，以去除残留的血清和衰老脱落的细胞及其

碎片。

2.消化一一加入适量（盖满细胞面即可）0.25%胰酶溶液，室温下（或37℃）消化

2〜3min后，在倒置显微镜下观察细胞单层，待细胞成片的收缩，出现许多空隙时即可

倒去消化液（若消化不够时可延长时间）。再加D-Hanks液轻轻洗一遍后倾出或直接进

行下一步操作。如在酶消化过程中见细胞大片脱落，表明消化过度，则不能倒去消化液

以免损失细胞，而需加入等量的培养液吹打、收集细胞，800r/min离心5min,弃上清

液后再进行下一步。

3.接种一一在培养瓶中加入适量的培养液以终止消化。用吸管反复吹打瓶壁上的

细胞层，直至全部细胞被冲下，轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液，按1:2或1:3分配，

接种到2〜3个培养瓶内，再向每个培养瓶中补加适量培养液进行培养。

4.观察一一细胞传代后，每天应对培养细胞进行观察，注意有无污染、培养液的

颜色变化、细胞贴壁和生长情况等。若细胞存活则称为传了一代。

（二）悬浮型生长细胞的传代（了解）

1.直接传代一一让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸去1/2〜2/3,然后用吸

管吹打形成细胞悬液后再传代。

2.离心传代

2.1在超净台内用小吸管将培养瓶内细胞吹打均匀，尤其将半贴壁细胞吹打起来。

2.2吸入离心管内，盖紧胶塞，与另一离心管平衡后置离心机中800r〜1000r/min

离心5min。

2.3离心后弃上清液，加入适量新培养液，用吸管吹匀，制成悬液

2.4按1:2或1:3分配传代培养。也可以计数后根据所需要的细胞浓度传至新的培

养瓶或培养皿中，放入温箱内继续培养。

【注意事项】

1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精

灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格

分开。

2.每天观察细胞形态，健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救,

可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常

更换培养基。

【思考题】

1.细胞传代培养的目的是什么？

2.为什么培养细胞长成致密单层后必须要进行传代培养？

3.如何保证在传代过程中不被微生物污染？

4.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同？

5.消化细胞的目的是什么？

6.细胞传代培养和细胞分裂之间有何联系?细胞传代培养1次是细胞分裂1次吗?

实验五细胞计数及活力测定

【目的要求】

1.掌握培养过程中细胞计数方法。

2.掌握使用台盼兰染色测定细胞活力。

【实验原理】

在细胞培养过程中，细胞悬液制备后，需要进行细胞计数，以确定细胞接种浓度和

数量以及了解细胞存活率和增殖度。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法

进行计数。

死活细胞鉴别有许多不同方法，其中最常用的是染色排除法。台盼蓝是一种酸性染

料，其不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使细胞着色，以此

来鉴别死活细胞。

【实验用品】

细胞计数板，细口滴管，纱布，培养基，0.4%台盼蓝，细胞悬液

【方法与步骤】

（一）细胞计数

1.计数板处理一一用无水乙醇或95%乙醇溶液冲洗计数板后，用绸布擦净，同时擦

净盖玻片一张。将盖玻片覆在计数板上。

2.加细胞悬液一一用无菌细口吸管吸取一滴细胞悬液，从计数板边缘缓缓滴入，

使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡。

并且该吸管使用后不能再次使用。

3.计数一一将计数板放在低倍镜（10X10）观察计数。

4.计数方法一一计数四角大方格（每个大方格又分为16个小方格）内的细胞数。

压线细胞只计左边线和上边线。根据下列公式计算细胞数：

细胞悬液细胞数/ml=4个大格细胞总数/4X稀释倍数X10000

（二）细胞活力的测定

1.分组一一分别吸取0.5ml细胞悬液于六孔板的1,2孔内。

2.造模型一一将lmol/LH2O2溶液加入其中1孔，放入培养箱内孵育30min,造成

细胞急性损伤。

三三

E

E

0

•

一

图7-4血细胞计数板

右上侧的小图示计数的规则;O表示可计数;・表示不计数

3.染色一一加样枪吸取0.5ml细胞悬液于1,2孔内，再加入0.5ml0.4%台盼蓝染

液，吸管打匀，染色1〜2min。

4.计数一一取一滴染色后的细胞悬液滴入计数板，计数每毫升细胞悬液中死亡的

细胞数（被染色的细胞）和活细胞数。

5.计算细胞活力

活细胞率（％）=［活细胞数/（活细胞数+死细胞数）］X100

【注意事项】

1、务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充分混匀细胞悬液。

2、充液后静止「2分钟，待细胞下沉后，方可进行计数。

3、对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。计

数时，如发现各中方格的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须重新计

数。

【思考题】

1.为什么细胞计数时，细胞悬液逸出凹槽外或有气泡时要重做？

2.为什么在细胞传代计数过程中，要用无菌吸管吸取细胞，滴加细胞后该吸管不能再

用？

补充实验：MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生蓝色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞

周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

【方法和步骤】

1、细胞悬液传于96孔培养板，置37℃、5%C0z温箱培养使细胞贴壁。

2、分组：将细胞分为两组，一为空白对照组，一为模型组。在模型组的细胞内加入Imol/L

的H2O2,在空白对照组的细胞内加入同样体积的三蒸水，在孵箱内孵育30min。

3、将培养板拿出，小心吸去孔内上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

4、每孔加入180口1新鲜RPMI1640培养液，再加入20口1MTT溶液（5mg/ml,即

0.5%MTT）,继续培养4ho

5、终止培养（可离心，1000rpm,10min）,小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150口1二甲基亚碉（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速

振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。

7、比较计算两组细胞的吸光值的均数。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

实验六培养细胞冻存和复苏技术

【目的要求】

1.掌握细胞冻存与复苏的基本原则。

2.熟悉细胞冻存与复苏的基本过程。

3.了解细胞的运输方法。

【实验原理】

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，可以防止细胞被污染或其他意外事件而使细

胞丢种，起到了细胞保种的作用；还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运

送某些细胞。在不加任何条件下，直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，

导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变，脱水、pH值改变、

蛋白质变性等，导致细胞死亡。但如果在培养液中加入保护剂如甘油或二甲基亚碉

（DMSO）,可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下使细胞内水分在冻结前析出细胞外，使

细胞免遭损伤。融解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的一5〜0℃后，细

胞仍能生长，活力不受损害。

当前最常用的保护剂为DMSO和甘油，它们具有对细胞无毒性，分子量小，溶解度

大，易穿透细胞的特点。使用范围在5%〜15%之间，常用浓度为10%。

采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。多数细胞以每分钟下降的速

度降至-20℃,冻结均可获得满意效果。细胞采用液氮保存法，温度可达-40℃^

190℃,细胞可长期保存。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速

解冻。

【实验用品】

1.器材一一液氮罐

2.试剂一一无菌冷冻管，冷冻保护剂，DMSO,培养液，0.25%胰酶溶液

3.材料一一PC12细胞

【方法与步骤】

（一）细胞冻存方法

1.取生长旺盛的细胞，倾去培养液，加入适量经37℃预温的0.25%胰酶溶液，消

化分散细胞。

2.弃消化液，加入2〜4ml含10%小牛血清的培养液，终止胰酶的消化作用。

3.吹打分散细胞，移入离心管内，平衡后以200r/min速度离心5min,弃上清液。

4.加入定量培养液使细胞悬浮，将细胞悬液移入无菌冻存管内。

5.在冻存管中加入DMS0,使DMS0的浓度为10%。

6.将冻存管放入纱布小袋中进行冻存。纱布袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注

明细胞名称，冻存日期，浓度等。

（二）细胞复苏

细胞复苏和冻存的方法相反，采用快融的方法。

1.迅速将冻存管取出，立即投入37℃温水中，并充分摇动，使其迅速融化，一般

Imin左右即可完成。

2.在超净台内将细胞悬液移入培养瓶内，加入适量培养液，轻轻吹打混匀。

3.将培养瓶放入温箱内，次日更换一次培养液，继续培养。

（三）细胞运输

装运细胞的方法有两种：一种为冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻

存，保存效果好，但较麻烦。另一简单的方法为保存细胞单层的运输，可根据路程时间

来选择细胞数量，一般以细胞长满1/3〜1/2瓶底为宜。去掉旧培养液，补充新培养液

到达瓶颈后，保留微量空气，拧紧瓶盖，并用胶带密封。运送时注意防震，防压。到达

目的地后倒出多余的培养液，仅保留维持细胞生长所需液量。37℃培养，次日传代。

【注意事项】

1.冻存时一般以1〜10℃/min的速度下降冻结为宜，可用程序控制冷冻仪控制。

如果没有该设备，可采用以下方法进行冻存：

将冻存管先置于4℃冰箱2〜4h,再移到一40〜―60℃低温冰箱1〜24h,然后立即

投入液氮罐内。

2.悬浮细胞的冻存方法同上，只是不需经胰酶消化步骤。

3.DMSO可高压灭菌，也可用无菌吸管在超净台内从DMSO瓶中吸出（不要碰瓶壁和

瓶口），加入培养液中，一般不会发生污染。DMS0是有机溶剂，不可与橡胶制品接触。

4.在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞

加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。

5.准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者的姓名。

【思考题】

1.细胞冻存和复苏的基本原则是什么？

2.简述细胞冻存和复苏的基本步骤。

3.影响冻存细胞活性的因素是什么？

4.冻存液的作用是什么？

第二章细胞工程

实验七(1)诱导细胞融合一聚乙二醇法

【实验目的】

掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。

【实验原理】

细胞融合(Cellfusion)是在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)

使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。由同种细胞融合形成的细胞，称为

同核体。利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体。人工诱导的细

胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，

也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究

的各个领域。

细胞融合的诱导物种类很多.常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus),聚乙

二醇(Polyethyleneglycol,PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易

得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂

的酰键及极性基团发生结构重排。

【实验用品】

一、材料鸡红细胞(核结构紧密，易于观察)

二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片、

滴管、烧杯、容量瓶

三、试剂

(DAlsver液：葡萄糖2.05g,柠檬酸钠0.80g,氯化钠0.42g,用柠檬酸溶液

调节pH值至7.2,最后用重蒸水定容至100ml即可。

(2)0.85%生理盐水：0.85g氯化钠溶于100ml重蒸水中。

(3)GKN液：氯化钠8g,氯化钾0.4g,磷酸氢二钠•2HQ1.77g,磷酸二氢钠•H20

0.69g,葡萄糖2g,酚红0.01g,溶于1000ml重蒸水中。

(4)Janusgreen染液。

(5)50%PEG混合液：称取少许PEG(Mw4000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加热，

使其溶化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀，置37℃备用。

注意使用前配制。

【方法与步骤】

1.鸡血红细胞悬液的制备：注射器内先吸入2mlAlsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2ml,

注入刻度离心管内，再加入6mlAlsver液混匀，使成为1：4(V/V)悬液。放入4℃冰

箱内可保存3—4天。

2.取细胞悬液1ml,移入10ml离心管，加入4ml0.85%生理盐水混匀。平衡后，1500r

/min离心5min。

3.弃去上清液(用吸管吸去)，加0.85%生理盐水至5mL混匀后，800r/min离心5min。

4.重复上述条件，再离心洗涤1次。

5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入适量的GKN液，配成10%(V/V)的红细胞悬

液。

6.取以上悬液以血细胞计数器计数，若密度过大，用GKN溶液稀释至3〜4X10,个/ml。

7.取悬液1ml于离心管中，置于37℃水浴中预热。同时将50%PEG液置于水浴中预热。

待温度恒定后，在细胞悬液中慢慢沿管壁逐滴加入0.5〜0.8ml50%PEG液，边加边摇

匀，然后放入水浴中。

8.20〜30min后,加入GKN液至8ml,静止于水浴中20min左右，以终止PEG的作用。

9.取出离心管，800r/min离心3min。弃去上清液，加GKN液，再离心1次。

10.弃去上清液，加入少量GKN液，混匀，取悬液1滴于载玻片上，加入Janusgreen

染液1滴,用牙签搅匀，3min后盖上盖玻片。利用光学显微镜或倒置显微镜(高倍)观察

2个靠近细胞或3个细胞形成融合的过程。进行多个视野的测定，统计平均融合率。

【结果观察】

1.在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体

细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。

2.融合率的计算

细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所

有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表尔，一般要进行多个视

野测定，求其平均值。

也可在高倍镜下随机计数200个细胞（包括融合的与未融合的细胞），以融合细胞

（含两个或两个以上的细胞核的细胞）的细胞核数除以总细胞核数（包括融合与未融合的

细胞核）即得出融合率。公式如下：

融合率=融合的细胞核数/总细胞核数X100%

【思考题】

1.细胞融合率受哪些因素的影响？

2.细胞融合时需注意哪些问题？

实验七（2）诱导细胞融合一电场法

【目的要求】

学习掌握电场法诱导细胞融合的方法。

【实验原理】

Zimmermann教授于1978年创立了细胞电融合的方法。首先，通过双向电泳使细胞间

的接触变得非常紧密。普通电泳采用直流电来移动分子，双向电泳则与之不同，采用了

高频交流电。在活细胞等微粒的内部，诱导去极化，引起细胞聚集，排列成串珠状，互

相紧密接触，在