CSTM-植物油 苯并（a）芘测定 超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法测定验证报告

植物油苯并（a）芘测定超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法验证报告项目主编单位：岛津企业管理（中国）有限公司参加验证单位：岛津企业管理（中国）有限公司国家粮食和物资储备局科学研究院2021年11月16日1.实验室基本情况表1.参加验证的人员情况登记表序号姓名专业职称或职务从事相关分析工作年限人员1郭彦丽分析化学高级专家15年人员2孙丽鹏分析化学科研员8年人员3黎睿食品科学与工程助理研究员9年人员4滕晓宇食品科学与工程研究实习员2年表2.使用仪器及部件登记表仪器名称规格型号出场编号性能状况(计量/校准状态、量程、灵敏度等）备注超临界流体色谱液相色谱联用仪1RF-20AXSL205055022259良好岛津设备超临界流体色谱液相色谱联用仪2RF-20AL20495706705良好粮科院设备2实验部分2.1试剂表3.使用试剂及溶液登记表名称生产厂家、规格浓度备注甲醇Fisher,4L,HPLC99.9%乙腈Fisher,4L,HPLC99.9%异丙醇Fisher,4L,HPLC99.9%正己烷Fisher,4L,HPLC99.9%苯并（a）芘甲醇标液中国计量科学研究院,2mL4.9μg/mL标准溶液1苯并（a）芘乙腈标液天津阿尔塔，1mL100μg/mL标准溶液2食用油中苯并芘定量分析质控样品中国检科院,20g11.53μg/kgPAH42.2仪器条件液相色谱条件：SFC色谱净化柱：Shim-packUC-XDiol4.6x250mm,5µm；预处理柱：Shim-packVP-ODS4.6x50mm,5µm；分析色谱柱:InertsilODS-P2.1x150mm,5µm；柱温：40°C；SFC流动相组成：A.超临界二氧化碳流体；B.甲醇；流动相参考梯度条件见表4。背压调节器（BPR）压力：15MPa，温度：50ºC。表4.超临界流体色谱洗脱条件时间/minA超临界二氧化碳(%)B甲醇（%）流速(mL/min）六通阀位置0.0098231-69.4998231-69.50010011-213.49010011-213.598231-62598231-6分析流动相：乙腈水混合溶液（体积比：9:1），1mL/min；进样体积：20µL；洗针液：异丙醇；荧光检测器：激发波长384nm，发射波长406nm；3结果和讨论3.1专属性和基质效应考察首先，针对植物油中检出概率高，并且毒性大的四种多环芳烃：苯并(a)蒽(BaA)、䓛（Chr）、苯并(b)蒽(BbF)和苯并（a）芘（BaP）在该系统上的分离度进行了考察。这四种化合物也是ECRegulation835/2011中规定的食用油中须限定多环芳烃。将BaA、Chr、BbF和BaP四种化合物的混标溶液（各250ppb）注入该系统，在上述条件下（2.2）进行分析，并在四个检测通道下（通道1：λex=384nm，λem=406nm；通道2：λex=257nm，λem=403nm；通道3：λex=267nm，λem=403nm；通道4：λex=290nm，λem=430nm）进行检测，结果如图1所示。其中，BaA出峰时间为14.9min。Chr出峰时间为15.2min，并且在Ex384nm/Em406nm检测条件下未检出。BbF出峰时间为16.3min。BaP出峰时间为17.2min。结论：由以上结果，可以看到，在该系统该条件下，通过色谱柱的分离能力和荧光检测器的选择性（λex=384nm，λem=406nm，沿用国标），BaP可以和其他三种危害较大的多环芳烃实现分离，并进行准确定量。BaPBaABaPBaABbFChr图1BaA、Chr、BbF和BaP混合标液分离色谱图进一步，在同样条件下，对苯并（a）芘与其同分异构体苯并（e）芘（BeP）混标溶液（各50ppb）在该系统上的分离情况进行考察。结果图2所示。BaP和BeP在该实验条件下能够实现基线分离，并且，在Ex384nm/Em406nm检测条件下，50ppb的BeP未能检出。因此，该色谱条件和荧光检测条件均能对BaP实现高选择性的检出。图2BaP和BeP混合标液分离色谱图进一步，对基质效应进行考察。按照标准测试程序分别对橄榄油空白基质、10μg/kg的苯并（a）芘标准溶液、加标后的橄榄油溶液（10μg/kg加标量）进行测定，色谱峰如图3所示。不含橄榄油基质的标液与橄榄油中的苯并（a）芘测得的峰面积几乎一致，说明该系统第一维能够有效去除橄榄油基质的干扰，使得在第二维进行苯并（a）芘检测时，可以得到和标准溶液几乎相同的响应。以上数据说明使用该系统，可以用外标法进行定量。图3BaP加标橄榄油分析色谱图3.2线性范围、检出限和定量下限该方法标准草案给出了方法的检出限为0.2mg/kg，定量限为0.5mg/kg，适用范围为0.5-50mg/kg。依据美国EPA标准，按照样品分析的全部步骤由岛津企业管理（北京）有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院联合测试大豆油、花生油、菜籽油三种空白样品，每种样品重复测试7次。数据如下：表5.方法检出限试验原始数据平行样品编号大豆油（μg/kg）花生油（μg/kg）菜籽油（μg/kg）10.460.2100.38820.440.2000.36930.4990.1800.32140.4500.2490.34050.5000.2000.36060.4690.1800.30270.4500.2490.321平均值0.4670.2100.343标准偏差S0.02390.02880.0309统计值t3.143.143.14方法的检出限LOD0.07490.09060.0971方法定量限LOQ0.2470.2990.320检出限计算公式：LOD=t（n-1，0.99）×S…………（1）式中：LOD——方法检出限；n——样品的平行测定次数；t——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布值（单侧），可通过查表获得。S——n次平行测定的标准偏差。定量限计算公式：LOQ=3.3×LOD……（2）结论：通过对大豆油，花生油和菜籽油三种空白植物油进行考查，验证了该方法检出限低于1μg/kg，定量限低于0.4μg/kg。将该方法的检出限和定量限分别设定为0.2μg/kg和0.5μg/kg符合要求。3.3精密度本标准的精密度试验是2021年8月-10月由岛津企业管理（中国）有限公司、粮食和物资储备局科学研究院按不同人员分组，采用不同仪器设备、和不同批次试剂材料对9个植物油样品按照样品分析的全部步骤进行测定，每个植物油样品进行两次平行测定。组合情况见表5，试验结果见表6、表7和表8。表6共同试验组合组别组合要素备注组合1岛津设备+试验人员1+标液1组合2岛津设备+试验人员1+标液2组合3岛津设备+试验人员2+标液1组合4岛津设备+试验人员2+标液2组合5粮科院设备+试验人员3+标液1组合6粮科院设备+试验人员3+标液2组合7粮科院设备+试验人员4+标液1组合8粮科院设备+试验人员4+标液2表7精密度试验原始数据类别橄榄油0.5ppb橄榄油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb组合10.662.011.0810.8551.792.0910.335.1621.030.622.000.8910.9351.132.0710.495.3221.25组合20.642.111.0510.1950.271.9910.405.1321.210.582.020.9510.3550.761.9810.325.2521.21组合30.612.100.9610.1649.881.8410.125.0219.720.582.001.0310.2950.011.939.995.4419.65组合40.622.181.1010.1050.492.1810.355.2820.900.612.081.0210.0050.272.1410.275.3320.84组合50.572.421.1311.7255.852.0011.206.2423.570.632.281.0811.3957.462.1511.485.7223.34组合60.542.091.1510.6352.752.0811.476.7622.120.622.221.079.3652.311.8312.456.5521.54组合70.612.190.9910.6352.052.4210.845.4521.700.842.081.0110.9152.642.1210.735.4121.69组合80.601.991.0010.7950.281.9610.335.1121.970.622.041.0510.6350.761.9610.455.3021.90表8单元平均值数据类别橄榄油0.5ppb橄榄油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb组合10.642.010.9910.8951.462.0810.415.2421.14组合20.612.061.0010.2750.511.9810.365.1921.21组合30.592.051.0010.2249.951.8910.055.2319.68组合40.622.131.0610.0550.382.1610.315.3020.87组合50.602.351.1011.5556.652.0711.345.9823.46组合60.582.151.1110.0052.531.9511.966.6521.83组合70.722.131.0010.7752.342.2710.785.4321.70组合80.612.011.0310.7150.521.9610.395.2021.94表9单元内方差s2类别橄榄油0.5ppb橄榄油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb组合11.05E-031.28E-041.86E-023.41E-032.17E-013.12E-041.34E-021.33E-022.24E-02组合21.72E-033.64E-035.43E-031.25E-021.20E-017.23E-052.91E-038.08E-036.55E-06组合34.07E-044.95E-032.00E-038.06E-038.17E-034.13E-038.18E-038.77E-021.97E-03组合41.18E-045.79E-032.97E-035.01E-032.45E-021.17E-033.35E-031.36E-031.89E-03组合51.61E-039.76E-031.20E-035.49E-021.28E+001.03E-024.03E-021.39E-012.59E-02组合63.36E-038.32E-033.16E-037.97E-019.87E-023.17E-024.81E-012.16E-021.72E-01组合72.58E-026.68E-036.12E-053.90E-021.76E-014.76E-025.57E-035.96E-046.53E-05组合81.98E-041.57E-031.49E-031.25E-021.16E-013.20E-077.68E-031.79E-022.48E-03对试验数据进行科克伦、格拉布斯统计检验，剔除高度异常值，并计算得到精密度数据，具体统计结果见表9和图4。表.10统计检验后保据留数情况及精密度数据类别橄榄油0.5ppb橄榄油2.0ppb花生油1ppb花生油10ppb花生油50ppb大豆油2ppb大豆油10ppb菜籽油5ppb菜籽油20ppb组合10.662.011.0810.8551.792.0910.335.1621.030.622.000.8910.9351.132.0710.495.3221.25组合20.642.111.0510.1950.271.9910.405.1321.210.582.020.9510.3550.761.9810.325.2521.21组合30.612.100.9610.1649.881.8410.125.0219.720.582.001.0310.2950.011.939.995.4419.65组合40.622.181.1010.1050.492.1810.355.2820.900.612.081.0210.0050.272.1410.275.3320.84组合50.572.421.1311.72-2.0011.20-23.570.632.281.0811.39-2.1511.48-23.34组合60.542.091.15-52.752.0811.47-22.120.622.221.07-52.311.8312.45-21.54组合7-2.190.9910.6352.052.4210.845.4521.70-2.081.0110.9152.642.1210.735.4121.69组合80.601.991.0010.7950.281.9610.335.1121.970.622.041.0510.6350.761.9610.455.3021.90总平均值0.612.111.0410.6451.792.0510.525.2721.48重复性限r9.64E-021.97E-011.84E-013.90E-011.42E+003.01E-013.00E-014.09E-014.70E-01再现性限R9.64E-023.41E-011.92E-011.46E+006.19E+004.11E-011.19E+004.09E-013.02E+00图4重复性限r和再现性R拟合曲线2.4正确度选取大豆油、花生油、菜籽油和调和油四种不同基质的植物油，分别精确定量添加苯并(a)芘标准溶液，配置浓度和不确定度见表11。岛津企业管理（北京）有限公司按照样品分析的全部步骤进行测试。用t检验来评定测试结果的正确度，检验公式为:测试结果见表12。表.11植物油中苯并（a）芘测试样品信息基体样品编号配置浓度（μg/kg）不确定度U（μg/kg）大豆油PA-I4.00.1PA-II15.00.5菜籽油PB0.70.06花生油PC35.01.1调和油PD45.01.4表.12植物油中苯并（a）芘含量分析结果样品名称编号测试结果平均值(μg/kg)标准差s指定值u0(μg/kg)不确定度uCRM正确度Y1(μg/kg)Y2(μg/kg)t0统计值t临界值大豆油PA-I3.963.863.90.0054.00.11.9956.314大豆油PA-II14.3814.3814.4015.00.52.400菜籽油PB0.870.830.95E-050.70.065.000花生油PC37.6937.6837.75E-0535.01.14.909调和油PD46.7248.3747.51.3645.01.42.101中国检科院质控样品103